Science丨柳文鹏/David Cortez揭示 RAD51介导同源重组绕过CMG促进复制叉反转

2023-05-06 13:50:54, BioArt

DNA复制是生物遗传的基础。正在复制的由亲本双链DNA和解旋复制形成的两条子代双链DNA形成的三叉结构称为“复制叉”DNA复制叉结构可以通过电子显微镜观察到（图一上）。DNA在复制过程中会持续的受到干扰，比如受到转录的干扰，异常的DNA二级结构，DNA和蛋白的交联，以及碱基损伤等等。这些复制过程中的干扰因素导致了复制压力（Replication stress）。DNA复制叉在受到干扰后会停滞，然后启动复制压力应答（Replication stress response）通路克服这些复制压力【1】。

复制叉反转（Fork reversal）是细胞在遇到所有类型复制压力时一种普遍发生的和最基本的应答反应，由复制叉反转酶（Reversal enzyme）介导产生【2】。复制叉反转是指两条新合成的DNA单链从双链上解旋脱落，由于相互之间存在同源序列而聚合成双链，亲本两条单链再次聚合重新形成双链DNA，而复制叉的位置由于这一过程的发生而反向后移，所以称为复制叉反转，反转后的复制叉也可以通过电子显微镜观察（图一）。

图一：复制叉反转（电镜图片来源于本文，模式图来源于doi:10.1038/nrm3935）

目前该领域内多数学者认为复制叉反转过程有助于克服复制压力，维持基因组的稳定【1】。但让人费解的是在体外生化实验发现，由于位阻原因，复制解旋酶CMG需要先从复制叉上解离，复制叉反转酶才能结合到复制叉上催化复制叉反转【3】。而在细胞中，CMG解离会导致DNA复制的失败，如果复制叉反转导致CMG解离导致基因组不稳定，所以据此推论复制叉反转是有害的。所以该领域长期争论的一个关键问题是：复制叉反转对基因组稳定性有利还是有弊。解决这个争论的核心在于回答在细胞中停滞的复制叉上，反向复制叉和CMG解旋酶是否可以同时存在；如果可以，复制叉反转酶怎样克服CMG的位阻催化复制叉反转。

2023年4月28日，美国范德堡大学生物化学系David Cortez实验室，华盛顿大学Alessandro Vindigni实验室与日本国立遗传学研究所的鐘巻将人实验室多个团队合作在Science杂志发表了题为RAD51 bypasses the CMG helicase to promote replication fork reversal的研究论文，回答了前面提到的这个长期以来的问题（第一作者：柳文鹏博士）。

研究团队首先通过复制叉蛋白组学分析发现复制解旋酶CMG在复制叉遭遇复制压力时并不会从停滞复制叉上解离，而复制叉反转发生与否也并不影响CMG在复制叉上的结合。研究人员构建了MCM2-Degron细胞系，通过使用5-ph-IAA药物诱导来快速降解细胞中的CMG。研究发现如果CMG从停滞的复制叉上解离，会造成复制叉重启失败。

如果CMG没有从停滞复制叉上解离，又不会阻碍复制叉反转发生，那么CMG在复制叉反转过程中位于哪里？通过邻位连接技术（PLA）实验，研究人员发现CMG存在于复制叉前方的双链DNA中，而反向复制叉发生在CMG后方，因而CMG不会妨碍反向复制叉的发生。

接下来的问题是CMG是怎样被放置到这个位置。研究人员注意到RAD51重组酶在多种复制叉反转通路中都是必需的【4】，但是RAD51怎样在细胞中促进复制叉反转并不清楚。结合CMG的位置，研究人员推测可能是由于RAD51介导了停滞复制叉附近的同源链入侵，这个过程将CMG包裹在同源重组形成的双链中，同时也生成了一个新的复制叉类似结构提供给复制叉反转酶结合从而在该位置上催化复制叉反转。为了验证该假设，研究人员用misFITs技术构建了表达外源RAD51突变的稳定细胞系【5】，通过多种单分子实验包括DNA纤维实验和电子显微镜实验，发现复制叉上的RAD51重组酶活性对于复制叉反转是必要的。为了进一步验证RAD51作用是帮助复制叉反转酶克服CMG位阻，发现当CMG从停滞复制叉诱导解离之后，复制叉反转过程不再需要RAD51的帮助。这个结果进一步验证了同源重组在复制叉反转起始时的重要作用。

通过一系列单分子实验和复制叉蛋白组学实验，该研究证明了CMG和反向复制叉可以同时存在。RAD51作为同源重组酶，在复制叉后方的单链DNA上形成DNA-蛋白复合体，然后在CMG后方介导了同源链入侵，这个过程创造了一个新的DNA三叉结构提供给反转酶使其催化复制叉反转。通过这样的方式，RAD51帮助复制叉反转酶克服了CMG的位阻。

图二：RAD51工作模式图

综上，该研究证明了CMG解旋酶在复制完成之前受到复制压力时并不会进行解离，而提前解离会导致复制重启失败进而导致基因组不稳定。通过解答该领域长期存在的悖论，证明复制叉反转这一基础生理学过程有利于基因组的稳定性。揭示了复制叉反转起始于同源链入侵，帮助人们进一步理解这一现象。该研究通过回答反向复制叉本质是什么，怎样发生，为进一步探索复制叉反转如何维持基因组稳定性以预防癌症等疾病，以及如何干预这些过程来治疗疾病奠定了基础。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.add7328

制版人：十一

参考文献

1. Berti, M., D. Cortez, and M. Lopes, The plasticity of DNA replication forks in response to clinically relevant genotoxic stress. Nature reviews Molecular cell biology, 2020. 21(10): p. 633-651.

2. Zellweger, R., et al., Rad51-mediated replication fork reversal is a global response to genotoxic treatments in human cells. Journal of Cell Biology, 2015. 208(5): p. 563-579.

3. Amunugama, R., et al., Replication Fork Reversal during DNA Interstrand Crosslink Repair Requires CMG Unloading. Cell Reports, 2018. 23(12): p. 3419-3428.

4. Liu, W., et al., Two replication fork remodeling pathways generate nuclease substrates for distinct fork protection factors. Science Advances, 2020. 6(46): p. eabc3598.

5. Michaels, Y.S., et al., Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications, 2019. 10(1): p. 818.