Nat Commun | 中国科大孙宝林团队S-亚硝基化修饰组揭示万古霉素耐药机制
2023-05-05 16:53:36, 景杰生物
杭州景杰生物科技股份有限公司
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景杰生物 | 报道
金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，由金黄色葡萄球菌引发的感染正严重威胁公共健康安全。金黄色葡萄球菌感染的耐药性也引起了越来越多的关注，万古霉素被认为是临床上治疗严重金黄色葡萄球菌感染的最后一道防线，但是万古霉素中度耐药性金黄色葡萄球菌（VISA）的频繁出现，为临床治疗带来了巨大挑战。
一氧化氮由一氧化氮合酶（NOS）催化生成，在调节生理和免疫功能方面发挥重要的作用。此外，NO还可以通过蛋白质半胱氨酸残基的巯基进行S-亚硝基化修饰，影响蛋白质活性和功能。金黄色葡萄球菌拥有一氧化氮合成酶，可产生内源性NO，该酶被报道参与调控金黄色葡萄球菌的万古霉素耐药性，但相关分子机制尚不明确。2023年4月21日，中国科学技术大学孙宝林教授在团队在Nature Communications（IF=17.694）发表了题为“Transcription tuned by S-nitrosylation underlies a mechanism for Staphylococcus aureus to circumvent vancomycin killing”的研究成果。该研究运用S-亚硝基化修饰组学技术，揭示了细菌一氧化氮合酶来源的一氧化氮通过介导转录因子MgrA或WaIR发生S-亚硝基化修饰，促进转录因子对自溶相关靶基因的负调控功能，导致细胞的自溶活性下降，介导细胞壁厚度增加，进而促进金黄色葡萄球菌的万古霉素耐药性。该研究有望为临床治疗万古霉素中度耐药性葡萄球菌及其他细菌病原体的感染提供新的思路与策略。景杰生物为该研究提供了S-亚硝基化修饰组学分析技术支持。1 金黄色葡萄球菌MgrA可由内源NO介导S-亚硝基化修饰
研究者首先对临床分离的VISA菌株-XN108进行了S-亚硝基化修饰组学检测，发现302个蛋白（占总蛋白的10.1%）的共484个半胱氨酸位点发生了S-亚硝基化修饰，这些蛋白涉及细菌生命活动的各个通路。发生S-亚硝基化修饰的蛋白中约8.9%的蛋白涉及转录与调控，因此研究者进一步聚焦在与抗生素抗性具有重要关联的转录因子MgrA上，MgrA上第12位的半胱氨酸残基发生了S-亚硝基化修饰。为进一步验证修饰组学结果的可靠性，研究者研究者通过WB对NO介导的的MgrAS-亚硝基化修饰进行了验证（图1）。图1S-亚硝基化修饰组学揭示内源NO介导MgrA的S-亚硝基化修饰2 NO介导的MgrA S-亚硝基化修饰促进金黄色葡萄球菌万古霉素的耐药性
研究者也进一步探究了MgrA的S-亚硝基化修饰对万古霉素耐药性的影响。研究者通过将12位半胱氨酸点突变为不能被修饰的丝氨酸构建了mgrAC12S点突变菌株。发现与NOS突变菌株类似，MgrAC12S点突变菌株对万古霉素的耐药性降低。研究者发现外源添加NOS抑制剂亦会导致VISA菌株对万古霉素耐药性降低（图2）。此外，外源性添加NO供体-硝普纳促进NOS敲除株对万古霉素的耐药性，而对MgrA点突变菌株与的耐药性没有促进作用，表明NOS产生的NO及其介导的MgrA S-亚硝基化修饰在金黄色葡萄球菌万古霉素耐药性过程中发挥了重要作用。图2 NO介导的MgrA S-亚硝基化修饰促进VISA菌株对万古霉素的耐药性3 MgrA的S-亚硝基化修饰参与调控细胞壁厚度和自溶活性
VISA菌株常表现为细胞壁增厚及细胞自溶活性降低，因此研究者对MgrA点突变菌株和NOS敲除株的细胞壁厚度以及自溶活性进行了检测，发现突变菌株和NOS敲除株的细胞壁变薄，细胞自溶活性均显著增加（部分自溶相关基因的转录水平发生明显上调）。上述结果表明，MgrA的S-亚硝基化修饰可能通过对自溶基因的调控进而调控细胞的自溶活性以及影响细胞壁厚度，增强金黄色葡萄球菌对万古霉素的抵抗能力（图3）。图3 MgrA的S-亚硝基化修饰参与调控细胞壁厚度和自溶活性4 去除S-亚硝基化修饰导致MgrA的DNA结合能力减弱
研究者进一步探索了MgrAS-亚硝基化修饰对自溶基因的调控机制。有研究发现，MgrA可通过与下游靶基因的启动子结合发挥直接的调控作用，因此研究者猜测S-亚硝基化修饰可能会通过影响MgrA与其靶标基因的启动子结合进而发挥调控功能。并通过实时荧光定量PCR、凝胶阻滞迁移实验、染色质免疫共沉淀实验等方法表明NO介导的Cys12位点MgrA的S-亚硝基化影响MgrA与DNA结合能力，从而干扰自溶相关基因转录，降低细菌自溶活性（图4）。图4 去除S-亚硝基化修饰导致MgrA的DNA结合能力减弱5 NO介导的WalR S-亚硝基化修饰促进VISA菌株的万古霉素抗性
研究者进一步探究了金黄色葡萄球菌中是否还存在其他转录因子参与万古霉素耐药性的发生。研究者对质谱鉴定到的另一个在第67位半胱氨酸发生S-亚硝基化修饰的转录因子WalR进行研究。研究者发现WalR的C67S点突变菌株表现出与NOS敲除株和MgrA点突变菌株类似的现象：对万古霉素的抗性显著下降、细胞壁变薄以及细胞自溶活性增加。以上结果表明金黄色葡萄球菌NOS内源产生的NO通过S-亚硝基化修饰介导的转录调控机制在细菌中可能具有普遍性。综上，该研究利表明S-亚硝基化修饰是调节金黄色葡萄球菌万古霉素耐药性的关键机制，为细菌研究提供了一个新的方向。该研究提示细菌NO合成酶抑制剂、NO清除剂或S-亚硝基化修饰抑制剂等的开发，有望为临床治疗VISA及其他细菌病原体的感染提供新的思路与策略。
参考文献
Shu X. et al. 2023. Transcription tuned by S-nitrosylation underlies a mechanism for Staphylococcus aureus to circumvent vancomycin killing. Nature Communications.
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