ADC的DAR值与其表征方法

2023-04-26 16:15:04, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司


ADC的DAR值

与其表征方法

ADC的临床疗效主要取决于连接头、药物和药物的性质,偶联位点的选择(赖氨酸、链间半胱氨酸、Fc聚糖)以及分析技术的改进。因此了解ADC的物理化学性质和选择适当的分析技术,以便在制造和存储过程中对其进行评估和质量监控尤为重要。


然而ADC由高特异性和高亲和力的抗体,高稳定性的连接头以及高效的小分子细胞毒药物所组成,其分子性质比较复杂,以至于表征更为困难,需要采用多种分析方法进行表征。


抗体药物偶联比(DAR)

DAR(drug-to-antibody ratio)是ADC药物特有的衍生词,其定义为:药物/抗体比率,即一个抗体所携带载药数量的平均值,DAR是平衡疗效和安全性的结果。抗体药物偶联比(DAR)是ADC最重要的质量属性之一,DAR决定了可以输送到肿瘤的“有效载荷”,直接的影响了ADC的安全性和有效性。


简单来说,ADC的效果与DAR直接挂钩。DAR可以理解为ADC这个魔法子弹所携带的载弹量,然而DAR的数值并不是越高越好。高DAR虽然拥有更大的载药量,但同时也更容易被人体的免疫系统锁定,从而被当成异物清除体外,减少ADC的有效性。因而大部分ADC药物的DAR限制在2-4之间。如何让DAR数值保持在一个合适的点,兼具疗效的同时还保持有效性,是目前仍在思索的问题。


DAR表征分析方法

偶联方式是影响DAR的重要因素,只有选择合适的偶联技术,才能让ADC的毒素均一稳定地连接在抗体上。有多种方法可以用于测量DAR值,根据不同的药物特性以及结合位点和连接子的结构,需要选取不同的测量方法。


常见的DAR表征分析方法有疏水作用层析(HIC)、反相液相色谱(RPLC)、液质联用(LC-MS)、紫外-可见(UV/Vis)光谱、毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)等方法,其中色谱和质谱是检测DAR值的两种常用方法。


疏水作用层析(HIC)

HIC-HPLC是一种成熟的技术,用于根据ADC的固有疏水性来分离ADC。目前,HIC被认为是研究半胱氨酸偶联的ADC药物分布、裸抗含量和平均DAR的标准方法,并且只需要很少的样品量。以DAR小于7-8的传统基于半胱氨酸的ADC通常产生主要的五个种类(DAR=0、DAR=2、DAR=4、DAR=6和DAR=8)和少量的奇数DAR物种。HIC柱可以根据每种DAR种类不同有效载荷数量的疏水性位移来分离混合物中的这些物种,生成的色谱图可以用于计算DAR(图1)。由于HIC可以在天然条件下分离DAR种类,因此它不仅用于DAR的分析测定,而且还用于纯化。结合位点特异性的偶联和通过HIC纯化可以制备位点特异性和均一的DAR ADC。

然而,HIC分离也有一些缺点。这项技术不能提供与MS分析的兼容性,因为HIC要求在流动相中有高初始浓度的低挥发性盐。HIC分离的另一个缺点是ADC种类的回收率较低。


反相液相色谱(RPLC)

RPLC最常被用于评估平均DAR。HIC和RPLC的主要区别是蛋白质在RPLC条件下变性。因此,半胱氨酸偶联的ADC不能被完整地洗脱,因为mAb的L和H链之间的链间二硫键被破坏。RPLC主要用于分离与H和L相关的还原ADC的DAR种类,也可用于天然ADC分离L、H、HH、HL和HHL片段。这些峰在RPLC条件下可以很好地分开,以允许计算平均DAR。在RPLC中,与固定相的相互作用主要是通过蛋白质的非极性氨基酸和固定的N-烷基配体之间的疏水作用来实现的。溶质按其分子疏水性递增的顺序洗脱。

RPLC方法的一个缺点是测量(柱温)所需的升高温度和使用胍和DTT联合使用的变性预处理都可能会降低ADC的种类。这种潜在的降解可能会导致通过RPLC计算的DAR低于HIC或其他分析的DAR。最近些年也报道了在没有任何样品预处理的情况下对完整的ADC进行RPLC分析。


基于质谱的分析法

质谱(MS)是另一种常用的ADC表征技术,目前可用的质谱仪通常是基于电喷雾电离(ESI)和飞行时间(TOF)进行检测,也可与具有扩展质量范围的Orbitrap相结合。质谱法适用于赖氨酸偶联的ADC的DAR值测定,包括液相色谱串联质谱和MALDI-TOF-MS。质谱法可分为变性与非变性电喷雾质谱法,两种不同的方法均是根据物质的分子量差异进行DAR的分析。抗体偶联上不同数量细胞毒性小分子后,ADC呈现分子异质性,不同的DAR物质在高分辨质谱的分析下具有不同的质荷比(m/z),然后根据相对应的DAR质谱信号峰强度或峰面积计算平均DAR值。


MS分析法的分辨率很高,足以区分ADC中不同类型的异质体,可用于分离、鉴定和定量检测不同类型的偶联分子,因此,可以根据检测到的具有不同DAR值的异质体的重量的平均值计算平均DAR值。ADC分子因偶联引入了更多的异质性,所以其MS分析方法较传统mAb的MS分析方法复杂得多。通常,需要尽可能避免抗体相关特征的干扰,以获取更多的ADC特异性结构信息。


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