简单实验搭配单细胞分析的高分文章！不学后悔！

今天跟大家强推这篇近期发表在Nat Comm上的单细胞解析肿瘤微环境生信好文！小编私以为就凭借这个思路，这个结果，但凡单细胞测序样本量再大一些，只发到NC都亏了！文章标题：A single-cell analysis reveals tumor heterogeneity and immune environment of acral melanoma.

肢端黑色素瘤(AM)是一种发生在肢端皮肤的黑色素瘤(CM)亚型，最近的研究显示，免疫疗法对黑色素瘤的治疗响应率可达到38%，但对AM的响应率只有16.6%。该研究旨在通过单细胞测序，从肿瘤异质性和免疫环境角度探索AM的内在特征。

作者将6例黑色素瘤患者的5例肢端和3例皮肤肿瘤样本（7个原发性和1个淋巴结转移，以及收集了一名接受免疫治疗的患者的治疗前和治疗后的样本）的单细胞测序数据作为发现集，并对从不同时间段收集的2个肢端黑色素瘤和1个皮肤肿瘤标本进行了scRNA-seq，作为内部验证集，并将已发表的9个肢端肿瘤样本的scRNA数据作为外部验证集。此外，还有57个黑色素瘤样本的bulk RNA测序数据（TMCH-57）、免疫荧光染色、细胞水平的药物治疗实验。

1.基于scRNA-seq构建黑色素瘤单细胞图谱

首先基于发现集数据（5例肢端和3例皮肤肿瘤样本）进行细胞聚类分群，再基于marker基因进行细胞群鉴定，确定了免疫细胞（T细胞，B细胞，自然杀伤细胞，单核细胞，巨噬细胞）和非免疫细胞（黑色素瘤细胞，内皮细胞，纤维母细胞）多种细胞类型。并且发现AM和CM的免疫细胞组成占比区别很大。

2.探究黑色素瘤肿瘤细胞的异质性

首先作者根据GO富集分析黑色素瘤肿瘤细胞的功能特征，并根据功能特征将黑色素瘤肿瘤细胞分为5个主要亚群（Signature1-5）。然后拟时序分析显示，5个肿瘤细胞亚群处于不同的发展状态（Signature2和3的细胞群可能是原始的肿瘤细胞，Signature1、4和5的黑色素瘤细胞处于发展的中期，分化较好）。

接下来，作者还探究了黑色素瘤肿瘤细胞功能特征的预后意义。首先基于Signature富集得分将scRNA-seq的6名患者分为C1/C2两组，发现这两组的总生存期有显著差异。然后将TMCH-57队列的57个样本和TCGA皮肤皮肤黑色素瘤样本分别聚类为C1/2组。一致地发现C1组显著富集Signature2、3，C2组显著富集Signature1、4、5，并且与C1组相比，C2组患者的总生存率更高。值得关注的是在TMCH-57队列中，几乎所有的CM样本都属于C1组，而C2组基本上由AM样本组成，而AM患者的总生存期比CM患者要好。据此推测AM和CM的生存差异可能源于具有不同功能的肿瘤细胞比例差异。

3.探究肢端黑色素瘤的免疫微环境

作者又对所有的免疫细胞重新聚类分析群，将它们分为6种细胞类型。其中T细胞群包括CD4+T细胞亚群，CD8+T细胞亚群和细胞周期T细胞亚群。T细胞亚群又可以再细分，比如CD4+T细胞又分为Treg细胞，CD4-CCR7, CD4-LEF1（CD4+Naive T细胞），以及CD4-NR4A1（组织常驻记忆T细胞）。细胞毒性T细胞亚群由CD8-GZMK和CD8-MT1E组成。CD8-PDCD1和CD8-LAG3亚群是免疫抑制性的CD8+T细胞。值得关注的是，AM中Tregs的浸润比CM中的稍高。8个样本（5个AM和3个CM）的多重免疫荧光染色证实FOXP3+Tregs在AM中确实比在CM患者中浸润更高，而其他T细胞亚群在AM与CM中没有明显的差异。

4.深入挖掘肢端黑色素瘤与皮肤黑色素瘤的CD8+T细胞分化状态

作者对鉴定到的6个CD8+T细胞亚群进行拟时序分析以探究其分化轨迹。结果将CD8+T细胞亚群分为三个阶段：从CD8-CCR7和CD8-NR4A1亚群开始分化，经过一个中间状态（即CD8-GZMK和CD8-MT1E亚群），在衰竭状态（即CD8-PDCD1和CD8-LAG3亚群）结束。同时发现早期和晚期状态细胞主要分布在AM和淋巴结转移的样本中，而中间状态则在CM中占主导地位。此外，与CM相比，AM的衰竭特征得分明显更高，而细胞毒性特征和驻留分数则明显较低。多重免疫荧光染色实验进一步证实PD1和TIM-3在AM中表达更多，而GZMB在CM中表达更显著。与CM相比，AM的CD8+ T细胞以衰竭状态为主，细胞毒性降低，这些也表明AM患者更有可能对免疫疗法产生抗性。此外，AM患者耗尽的CD8+ T细胞以PD1和TIM-3的高表达为特征。因此，选择性多靶点免疫疗法可能有益于AM患者。

5.抗TIM-3和抗PD1联合治疗可增加AM的肿瘤细胞凋亡率

作者通过体外细胞实验，进一步探讨联合应用抗PD1和抗TIM-3可能使AM患者受益。从AM和CM患者的新鲜肿瘤组织中分离出肿瘤细胞和CD8+T细胞。将CD8+T细胞分为4组，用不同的免疫检查点抑制剂药物（包括抗PD1、抗TIM-3、抗PD1+抗TIM-3和对照组）培养1小时，然后与肿瘤细胞共培养24小时，检测肿瘤细胞的凋亡比例。结果显示，抗PD1联合抗TIM-3组的AM肿瘤细胞凋亡比明显增加，联合组呈现叠加效应。因此，该结果提示可用抗PD1和抗TIM-3联合治疗克服AM免疫治疗耐药性。

6.肢端黑色素瘤免疫耐受患者治疗前后的差异

作者比较了一名患者免疫治疗前后的两个样本(Acral3-pre和Acral3-post)中免疫细胞比例的变化。发现治疗前的样品具有更多的CD8+T细胞和循环T细胞，而处理后的样品在CD4+T和B细胞占比更多。然后比较了这两个样本之间CD8+T细胞的差异表达基因以及发育轨迹。多重免疫荧光染色实验结果进一步证实，在治疗后样本中，CD8+T细胞比例下降，而CD4+T细胞和B细胞比例上升。接下来又用两个接受免疫治疗的黑色素瘤患者的数据集验证得到类似的免疫细胞比例变化趋势。总之接受抗PD1治疗后，CD8+T细胞的细胞毒作用降低，原有的免疫相关功能丧失。这些可能是该AM患者的抗PD1治疗无效的原因。

最后，作者又通过inferCNV分析，发现在治疗后的样本中4号染色体的基因组扩增明显，还筛选到44个治疗前后组间差异表达基因（可能与免疫治疗抗性有关）。这44个基因在EGFR和细胞周期通路中富集。这意味着免疫治疗结合EGFR通路相关基因（TRIM2、GAB1、SPRY1）抑制剂可能会提高免疫治疗的效果。

小编有话说

这篇文章思路主线清晰明确（比较AM与CM患者肿瘤微环境异质性，以及探究AM免疫治疗抵抗的原因），用简单的生信分析方法挖掘到有深度的研究结论（通过生信结果给出治疗指导策略），美中不足的就是治疗前后scRNA样本数太少了，使免疫治疗部分生信结果不那么有说服力，还好有实验验证支持生信结果。总之看完给人的错觉就是：发NC，so easy！

文章分析思路简单，单细胞分析方法也是常规的，你有心动吗？前提是你得会这些分析，才有可能利用合适的思路，发表自己的单细胞高分文章！