文献详解|如何一套数据发多篇文章，案例这不就来了嘛！

2023-04-17 13:41:15, 生信小师妹

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上周提到目前组学数据资源最丰富的RNA测序数据，除了基于RNA的定量结果的常规思路及分析方法，还可以从不同角度（比如RNA结构）对同一套数据进行挖掘，以期一套数据发表多篇文章。今天就以文献案例跟大家分享，基于RNA结构（可变剪接）的发文思路。文章标题：Comprehensive characterization of alternative splicing in renal cell carcinoma.

研究背景

肾细胞癌（RCC）由各种病理亚型组成，包括肾透明细胞癌（KIRC）、肾乳头状肾细胞癌（KIRP）和肾嗜铬细胞癌（KICH）。异常的可变剪接已经被认为是剪接调控序列突变（顺式作用）或由异位RNA结合蛋白调节（反式作用）的结果，在癌症和许多其他疾病中起着不可或缺的作用。

研究思路

通过TCGA SpliceSeq数据库中的剪接数据，对RCC亚型进行分类，并系统分析了剪接特征及其与临床过程、遗传变异、剪接因素、通路激活和免疫异质性的相关性。此外，还探究了可变剪接的潜在调节机制。

研究结果

1、基于剪接特征进行RCC亚型聚类并探究亚型临床特征

首先分析了TCGA数据集中KICH、KIRC和KIRP患者的综合剪接谱（包括典型的五种剪接类型--替代接受位点（AA）、替代供体位点（AD）、外显子跳过（ES）、互斥外显子（ME）和保留内含子（RI）），展示了在KICH、KIRC和KIRP的选择性剪接事件（ASEs）和相关基因的数量及其比例，筛选到三种RCC亚型共有的22839个ASEs。然后基于共有的ASEs，通过t-SNE分析对1018个RCC样本进行聚类。最后通过综合考虑TCGA临床数据的诊断（TCGA亚型）、文献中修订的分类、回顾病理报告和拼接聚类分析，重新定义了肾癌样本的亚型分类，总之，剪接聚类分型结果将患者分离出更多的小类，包括KICH-MD亚型和KIRP-CL亚型，这两种亚型的样本与其他KICH或KIRP总生存期明显较低。此外，KIRC的样本被进一步划分为四个亚型，包括KIRC-T1、KIRC-T2A、KIRC-T2B和KIRC-T2C。

接下来探究剪接亚型间患者的临床特征差异。首先Kaplan-Meier图显示这些KIRC亚型的生存预后有明显差异。临床相关性分析进一步比较了亚型间患者病理肿瘤大小（T）、远处转移（M）和TNM分期等临床特征。总之结果表明可变剪接在不同的RCC组织病理学类型中是不同的，并且与临床特征和患者的生存高度相关，这说明可变剪接适合于RCC的亚型分类。

2、RCC亚型特异性DASEs的拼接特征

首先差异性可变剪接分析显示，与正常对照相比，在所有RCC亚型中发现了上调的差异剪接事件（DASEs）比下调的DASEs多。为了描述可能导致KIRC-T2B与KIRC-T1相对恶性的基于剪接的机制，用Metascape对这两种亚型的上调和下调的DASEs相关的四个基因列表进行了富集分析。最后作者还挑选了富集通路中的三个基因（SYK，MYH11，ICAM3）通过RT-PCR在KIRC组织中进行验证。总的来说，KIRC-T1和KIRC-T2B中癌症相关途径剪接变化的异质性和统一性可能表明可变剪接在肿瘤发生和维持癌细胞生存中的不同作用。在以剪接低效为特征的侵袭性KIRC亚型中，异常剪接可能通过调节癌症生物途径中基因的异构体转换和mRNA表达来促进癌症的发展。

3、RCC亚型中特征性的富集基因集和不同的剪接调节模式

为了广泛研究通路和剪接之间的潜在关系，作者首先对所有RCC样本进行了GSVA分析以探究不同剪接亚型患者的功能异质性。然后进一步探究了每个亚型关联度最高的前200个基因集的功能。发现在KIRC和KIRP集中于对刺激的反应（RTS），而在KIRN中集中于生物质量的调节和转运器活性。这些结果描述了RCC亚型和正常组织之间的细胞内和细胞外环境的差异以及相应的不同剪接调节机制。

最后作者分析了32条剪接途径（SPs）、29条富集对刺激的反应（RTS）途径和521个剪接因子（SFs）在KIRC中对ASEs的影响。结果发现ASE与SPs和RTS途径负相关，与SFs正相关。而且，维恩图显示，SP相关的ASEs主要包括在RTS途径相关的ASEs中。此外，在所有KIRC亚型中，KIRC-T2B中特异性上调的SFs多于共同上调的SFs，表明这些亚型的特异性变化，包括KIRC-T2B中SFs的途径激活和表达，可能与它的严重异常剪接共同相关。

4、基因组变异导致RCC的剪接缺陷

作者对RCC剪接亚型进行突变分析，发现KICH-MD的突变负荷相对高于KICH-T，KIRP-CL，低于KIRP-T。进一步在KIRC-T2B中发现SFs SRRM2和PPRF8比其他KIRC亚型的突变频率更高，推测SRRM2和PPRPF8的突变可能部分导致了KIRC-T2B的严重异常剪接。

然后，作者基于CancerSplicingQTL数据库分析了33种人类癌症的剪接定量性状位点（sQTLs），发现268,412个SNPs可能与KIRC中4891个ASEs相关。基于这些数据，通过与剪接片段相关的位置，进一步将这些sQTLs分为染色体、基因、外显子和剪接区。通过比较不同区域每百万碱基的剪接相关SNPs的数量，发现外显子和剪接区的SNPs更可能影响KIRC的可变剪接。

5、与RCC中异常剪接相关的肿瘤微环境和免疫异质性

剪接相关抗原（SRA）可能会影响免疫反应并作为生物标志物。在此，作者通过免疫相关的基因特征进行了GSVA分析，以研究RCC亚型之间的免疫异质性及其与异常剪接的相关性。血管生成已被证实是免疫细胞浸润的一个先决条件，在该研究中，与其他RCC亚型相比，KIRC患者的免疫细胞浸润更高。此外，KIRC-T2B的血管生成、缺氧和HIF-1α特征明显低于其他KIRC亚群。尽管异常可变剪接越严重意味着剪接相关抗原（SRA）越多，但除了总T细胞、调节性T（Treg）细胞、γδT（Tgd）细胞和自然杀伤（NK）细胞外，KIRC-T2B中大多数免疫细胞的浸润都低于其他KIRC亚型。