Nat Commun丨少样本数量、多样本类型的蛋白质组学怎么发高分?

2023-04-12 13:36:18, 小迈 武汉迈特维尔生物科技有限公司



蛋白质组学分析揭示了鳞状细胞癌和腺癌在多种组织中的关键差异


 摘要

鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(AC)是实体癌的两种主要组织学亚型。然而,鳞状细胞癌来源于具有相似形态的不同器官,区分转移性鳞状细胞癌的起源具有挑战性。SCC和AC之间的蛋白组学比较确定了可区分的关键途径,这些途径中的分子在SCC和AC中起着一致的不良或相反的预后作用。常见和罕见鳞状细胞癌之间的比较突出了脂质代谢可能会加强罕见鳞状细胞癌的恶性肿瘤。蛋白组学簇揭示生理学特征,激酶-转录因子网络显示差异性鳞状细胞癌特征,而免疫亚型揭示了多种肿瘤微环境,并确定了潜在的药物靶点。此外,肿瘤特异性蛋白为候选者提供了差异诊断价值。


实验设计



实验结果


117例SCCs的蛋白质组学分析

本研究汇集了来自治疗初期SCC患者的333份原发肿瘤样本,包括10个常见SCCs部位(图1a):鼻咽(20)、口腔(22)、喉咙(20)、皮肤(20)、食道(20)、肺(20)、子宫颈(21)、阴茎(22)、阴道(21)、会阴(20);和七个罕见的SCC部位:甲状腺(13)、胸腺(21)、乳腺(20)、胰腺(21)、胆囊(20)、膀胱(22)、肛门(10)。蛋白质组学研究中采用了4D方法,验证研究中对样本采用了基于组织微阵列(TMAs)的免疫组织化学(IHC)策略。


评估并总结了所有病例的临床和病理特征,包括性别、年龄、肿瘤分化、角质化、细胞巢大小、细胞大小、有丝分裂像、基质比率、基质炎症和癌症炎症(图1b)。通过估计计算估计评分、免疫评分和基质评分。平均随访32个月(3 ~ 160个月)。对于低发生率的SCC,68名患者无结局信息。这些患者也包括在本研究中,但未包括在生存率分析中。pan-SCC队列的总生存期(OS)和无病生存期(DFS)在各器官间差异有统计学意义。多变量分析显示,OS和DFS均与年龄和分期相关。SCC来源与OS和DFS无关。17个SCC的分化和角质化程度不同。位于甲状腺、胰腺和胆囊的SCC细胞巢较其他器官小。ESTIMATE分析的基质评分与病理评估的基质比率趋势一致。免疫评分和估计评分的多样性促使我们探索跨SCC的免疫微环境(图1b)。


对于蛋白质组分析,解剖了肿瘤细胞> 80%的SCC区域,然后在timsTOF Pro质谱仪上进行高分辨率LC-MS/MS分析(图1a)。所有333份样本的Spearman相关性在0.56至0.99之间(中位值= 0.74),表明癌症类型之间具有高度相关性。总体上,对14840个蛋白质组进行了定量(肽和蛋白质水平的错误发现率(FDR)为1%,强度高于500)。平均而言,每个样本的SCC蛋白质组有8120个蛋白质组,范围从甲状腺中的最小6261到胸腺中的最大9296,并且在17个SCC之间表现出覆盖差异(图1c),并且5648个蛋白存在于所有17个SCC中。进一步数据过滤后进行所有下游统计分析,以仅保留至少1/3样本中鉴定的蛋白质。这些列表共14598种蛋白质,包括229种磷酸酶、318种激酶、1723种膜蛋白、489种癌基因、520种肿瘤抑制基因、918种转录因子和1605种药物靶点,表明足够的覆盖范围可用于细胞内过程分析。


在图1d中列出了关键分子的蛋白质组数据,这些数据在以前的基因组学研究中得到强调或作为诊断标记。krt 5(333个样本的CV:0.083)和TP63(333个样本的CV:0.069)作为已知的SCC诊断标记物,在所有SCC中显示出高且普遍的表达水平。EGFR和CD274 (PDL1)作为鳞状细胞癌有限治疗靶点,在所有鳞状细胞癌中表达水平相似。频繁拷贝数增加基因AKT1在所有病例中普遍表达(333个样本的CV:0.060),而YAP1、AKT3和SOX2在蛋白质水平上表现出不同程度的表达缺失(AKT1、YAP1、AKT3和SOX2),表明在17个SCC中存在差异激活的信号。类似地,包括TP53、PTEN和FGFR3在内的频繁突变的肿瘤基因,在17例SCC中表现出不同程度的蛋白表达缺失(P53、PTEN和FGFR3)。通过探索和参考人类蛋白质图谱(https://www.proteinatlas.org),还观察到组织特异性蛋白质的表达在全球范围内丢失,这表明泛SCC群组的高肿瘤纯度。这些结果肯定了本研究蛋白质组数据的高质量,本研究迄今为止已经建立了中国鳞状细胞癌的系统蛋白质组学格局。


    

Fig.1 泛鳞状细胞癌(SCC)队列蛋白质组学


2SCCs与ACs的蛋白质组学比较

SCC和AC是最常见的组织学癌症亚型。初始生物信息学分析通过将333个SCC与一个独立的AC队列进行比较,检查了SCCs和ACs之间的功能差异,该ACs队列由来自7个部位的69名ACs患者组成:乳腺(8例)、甲状腺(10例)、肺(11例)、胃(12例)、胰腺(8例)、胆囊(12例)和结肠直肠(8例)(图2a)。为了探索SCCs和ACs的蛋白质组学覆盖范围,首先在批次效应去除后对结肠直肠(SCCs队列中的肛门)、乳腺、胆囊、肺、胰腺和甲状腺的SCCs和ACs之间的已识别蛋白组进行了成对比较。Venn图显示,每次比较中重叠占总数的大部分,表明各组的可比性。此外,这6对SCCs和ACs的主成分分析和相关性分析显示,不同组织来源的SCCs和ACs的蛋白质组具有多种相关性特征。


在SCCs中鉴定的14598个蛋白中,5130个蛋白在所有17个SCCs中普遍表达。同时,在所鉴定的10414个ACs蛋白中,有4845个蛋白在所有7个ACs中共同表达。为了比较ACs和SCCs之间的差异,基于Uniprot IDs将这两个蛋白列表合并到一个数据集中(图2a)。总共有1538个蛋白显示出显著的差异表达,其中643个蛋白在ACs中过表达,895个蛋白在SCCs中过表达(图2b,c)。GSEA表明,AC中显著富集的途径包括核糖体(如RPS27A、RPL4和RPL6)、体液免疫应答(如C3、FGB和C1R)、细胞外基质(ECM)(如ANXA2、FN1和S100A10)、氧化磷酸化(如SDHA、HADHB和NDUFS2)和糖异生(如ALDOC、ENO1和GAPDH),而泛素蛋白连接酶活性(如间变性蛋白5、MED21和PPP1R11)、转录因子复合物(如AJUBA、RUNX3和GTF2H1)、p53下游途径(如TP63、BAK1和SERPINE1)和对病毒的防御反应(如APOBEC3F、CGAS和EIF2AK4)在SCCs中占优势(图2d)。这些观察结果表明,SCCs和ACs之间的显著差异符合起源上皮组织的特性。


为了研究这些显著差异表达的蛋白(DEPs)如何影响预后(泛SCC队列的多变量Cox比例风险模型,9个TCGA癌症队列的Kaplan-Meier生存曲线,对数秩检验),在作者的数据集和9个TCGA数据集(包括4个SCC(头颈部、食管、肺和子宫颈)和5个ACs(乳腺、肺、胰腺、结肠和子宫颈))中测试了DEPs在这些途径中的预后能力。在这种严格的分析下,在泛SCC队列中,RPL12作为良好的预后标记,SERPINE1作为不良的预后标记。引人注目的是,在ACs和SCCs中,ECM中的DEPs (如COL4A1、FN1和PKM)和AC富集途径的葡萄糖代谢(如SDHA、LDHA和ENO1)始终显示出较差的预后价值,表明无论肿瘤组织学类型如何,肿瘤代谢状态和微环境都可能促进肿瘤的发生和发展(图2e)。相反,角化过程中的DEPs(如KRT13、DSC3和PKP1)表现出相反的作用,在SCCs中表现出良好的预后价值,而在ACs中则不理想(图2e)。此外,肺和胰腺腺癌的预后,这是两种预后不良的癌症,被ECM、葡萄糖代谢和角质化方面的DEPs显著影响。


为了进一步阐明ACs和SCCs之间差异的潜在机制,使用GENEMINIA构建了图2e所示途径的计算模型,以预测可能针对这些DEPs的激酶和转录因子(TFs)相互作用。如图2f所示,富含参与ECM和葡萄糖代谢的ACs的DEPs由8种激酶-8TFs网络介导,代表性地由PRKAA2/PKM-ENO1和PKM-HNRNPD/YBX1轴介导。角质化由11种激酶-5种TFs网络介导,主要由CHUK-TP63/IRF6轴介导。还检测了ACs和SCCs中这些激酶-TFs的预后。与这些DEPs中的发现一致,发现PKM-ENO1在胰腺腺癌和HNSC/ESCC中显示出一致的不良预后值,而VRK2-TP63在胰腺腺癌中显示出不良预后值,在ESCC/LUSC中显示出良好预后值。总之,这些在SCCs或ACs中过度表达的通路、DEPs和激酶-TF网络代表了独特或共有的生物学和临床病理学特征,进一步强调了它们的临床意义。


    

Fig.2 pan-SCCs和pan-ACs的蛋白质组学差异



3罕见SCCs与常见SCCs的蛋白质组学特征比较

为了研究病理参数(常见与罕见、分化、角质化和细胞巢大小)如何影响蛋白质组和信号转导,于是在常见与罕见、低分化与中/高分化、中/低角质化与高角质化以及小肿瘤巢与中/大肿瘤巢之间的患者中分析DEPs (图3)。高分化水平和高角质化表现出非常相似的过度表达途径,包括角质化、基质和中间丝细胞骨架。低角质化患者线粒体、细胞氨基酸代谢过程、mRNA加工等通路升高。最近有报告称,RNA processing与头颈部SCC的发生有关,因为拷贝数驱动因子参与了该途径,这表明该事件在低角质化样本中可能更频繁发生。细胞巢大小参与了肺、口腔和食管SCCs的新型组织病理学分级系统,被认为是小巢与不良预后相关的预后形态学参数。大细胞巢蛋白质组在染色质组织、去磷酸化、催化复合物、序列特异性DNA结合和含磷基团转移酶活性转移中过度表达,而小细胞巢蛋白质组在细胞表面、肽代谢过程、内质网、肽酶活性和基质中过度表达。小细胞巢过多,具有较高的代谢和蛋白质合成表型,类似于低角质化。


为了全面了解常见SCCs和罕见SCCs之间的区别,比较了这两组SCC的蛋白质组学特征。PCA分析显示,常见和罕见SCCs之间存在明显差异,表明SCCs的发育和进展过程中存在显著的蛋白质组差异(图3a)。共6213个蛋白进行比较,普通SCCs与罕见SCCs共差异表达938个蛋白,其中,500个蛋白在普通SCCs中上调,438个蛋白在罕见SCCs中上调。


图3b显示了333例患者的SCCs类型与临床病理特征之间的相关性。常见/罕见SCCs类型与性别、分化、角质化、肿瘤巢大小、病理有丝分裂像、间质炎症和免疫评分相关。罕见SCCs与分化差、角化程度低、细胞巢大小小、基质炎症低、免疫评分低等较差病理特征呈正相关。然而,在罕见的SCCs中意外发现较少的有丝分裂像(图3b)。


Reactome(https://reactome.org/)的途径富集分析表明,常见SCCs在以下途径中显著富集:角质化(如KRT5、KRT6B和CSTA)、细胞粘附(如CELSR2、GNA15和IL1RN)、皮肤发育(如HPSE、SCEL和GRHL2)和凋亡信号(如SNCA和TNFSF10)。罕见SCCs的蛋白主要参与脂代谢(如PLIN1、PLIN2、TM7SF2)、ECM组织(如ITGA7、POSTN、COL5A2)、弹性纤维形成(如FBN1、LOX)、胰岛素信号传导(如GRB10、IGFBP7)、维生素B5代谢(如ENPP1、ENPP2)等通路(图3c、d)。特别是,PLIN1在罕见SCCs中高度表达,而在大多数常见SCCs中未检测到(188/288)(图3e)。然后,在十个病例中对每个SCCs的PLIN1拷贝数进行了检测。有趣的是,通过荧光原位杂交分析在3个肛门SCCs中检测到基因扩增(3/10,图3f),表明PLIN1在罕见SCCs中高表达的潜在机制。


考虑到TFs在致癌和侵袭性中起重要作用,重点研究了常见和罕见SCCs之间的差异表达TFs。其中10种TF在罕见SCCs(如AEBP1、FOXO1、RUNX2、TBL1X、FOXK2等)中过表达,33种在常见SCCs(如TP73、BCL11B、HDAC3、RTF1、KDM2A等)中过表达(图3g)。通过TF-TG富集分析,两种TF(RUNX2和FOXO1)在罕见SCCs中过表达,调控大多数TG,表明其在罕见SCCs中具有优势生物学功能(图3h)。调节骨骼形态发生的RUNX2和调节细胞对氧水平反应的FOXO1参与脂质代谢。有趣的是,据报道FOXO1可以抑制RUNX2的转录活性。还发现罕见SCCs中RUNX2和FOXO1的蛋白丰度呈负相关(图3i)。anti-RUNX2、FOXO1和PLIN1 IHC验证了RUNX2和FOXO1呈负相关的证据,两个病例均显示PLIN1染色阳性(图3j)。总之,这些数据表明,脂质代谢可能更活跃,并在罕见SCC的鳞状细胞分化中发挥关键作用(图3k)。这一发现揭示了通过对RUNX2、FOXO1和PLIN1染色来诊断罕见SCC的机会。


    

Fig.3 常见SCCs与罕见SCCs的蛋白质组学差异


4基于蛋白质组的17例SCC分层聚类分析

基因组和转录组信息已用于将SCCs分组;然而,基于蛋白质组的聚类的深入覆盖仍然缺乏。正如预期,t-SNE分析显示,来自同一器官的样本倾向于聚集在一起,表明SCCs来源的组织类型更相似(图4a)。为了确定基于蛋白质组特征的分类,对17个SCC的333个肿瘤样本进行了分层聚类。因此基于1500个最易变蛋白鉴定了四种与解剖部位显著相关的蛋白质组亚型,并揭示了蛋白表达和信号转导的区别模式(图4b)。

簇1 (EOST,以每个器官的首字母命名,按字母顺序排列)包括食道、皮肤、口腔和喉咙,与细胞骨架功能和免疫相关,如细胞骨架蛋白结合、KRAS信号下调、补体和先天免疫系统(图4b,c)。簇2 (LNT)包括胸腺、肺和鼻咽,以最高水平的需氧氧化为特征,包括线粒体、磷脂代谢、氧化磷酸化和TCF依赖性信号传导。簇3 (BBGPT)由乳腺、甲状腺、膀胱、胆囊和胰腺组成,均为罕见的SCCs。ECM糖蛋白、脂肪酸代谢和炎性反应途径富集,因此与ACs具有非常相似的特征(图2d和4d)。BBGPT在这4组中预后最差。组群4 (ACPPV)为所有肛门生殖器SCC,包括阴茎、会阴、肛门、子宫颈和阴道,预后最好。值得注意的是,人乳头瘤病毒感染频率高的ACPPV富集了细胞周期检查点、E2F靶点和程序性细胞死亡。此外计算了4个聚类中所有DEPs的预后值(多变量Cox比例风险模型),在这些DEPs中发现了两种具有预后值的蛋白。蛋白ATM与预后良好相关,MMP19与预后不良相关(图4e)。


为了阐明潜在的差异SCCs起始机制,匹配了来自这4个簇的所有DEPs的激酶,并将它们映射到kinmap 50(http://www.kinhub.org,图4f)。簇1的特异性激酶主要属于CAMK和AGC,如HUNK、SIK1和MAST1,参与免疫反应。簇2的激酶广泛分布在所有激酶类别中,主要参与氧化磷酸化(如LRRK2、RAF1和BRAF)。簇3的特异性激酶分布在TK、CAMK和CMGC中,主要参与脂质代谢(如NEK10、DAPK1和SIK2)。簇4的特异性激酶主要属于AGC、CAMK和CMGC,参与细胞周期(如CDK4、PLK1和AURKB图4f,g)。进一步使用GENEMINIA对每个簇进行了四个激酶-TF网络,并且多个TFs可以由参与每个簇的优势途径的那些激酶调节(图4g)。总之,这四个蛋白质组簇揭示了解剖学特征,并潜在地表明了不同的SCC起始。


    

Fig.4 pan-SCCs的蛋白质组簇及其与SCC起始的关联


5SCCs的免疫前景及其潜在的药物洞察力

为了深入了解SCC的免疫特征,接下来使用xCell分析了所有333种肿瘤的TME成分,包括deconvoluted immune,stroma的基因特征和64种不同微环境的细胞类型。基于推断细胞比例的共识聚类确定了6种SCCs亚型,具有不同的TME特征和预后,通过特定细胞类型和途径的优势存在进行区分(图5a,b)。在该Pan-SCCs队列中定义了六种亚型:(1)典型鳞状上皮(ClSq)、(2)脂肪酸代谢(FaSq)、(3)嗜碱性粒细胞炎症(BaSq)、(4)中性粒细胞炎症(NeSq)、(5)嗜酸性粒细胞炎症(EoSq)和(6)Immune hot (IhSq),以独特的TME信号和区别性信号通路为特征(图5a)。这些基于分子的细胞类型分类得到组织病理学评估的支持(图5c,d)。在FaSq亚型中检测到PLIN1阳性(图5d)。


ClSq亚组,包含膀胱(21)、食管(13)、皮肤(13)、口腔(11)、肛门(10)、胰腺(4)、乳腺(2)、胆囊(1)和会阴(1)SCC的混合物。不仅随着簇EOST的富集,肛门和大部分膀胱SCC落入ClSq。可能的原因是膀胱(如慢性血蓝杆菌感染)和肛门[如人乳头瘤病毒(人乳头瘤病毒)感染]受到外界刺激的影响,这两种情况与呼吸性SCCs相似。ClSq的特征是上皮细胞、皮脂细胞、角质形成细胞和成纤维细胞高度富集。值得注意的是,ClSq肿瘤还显示存在免疫抑制细胞,如调节性T细胞。蛋白质组分析显示,FGFR3、白细胞跨内皮迁移和补体等信号通路上调(5b)。此外,ClSq肿瘤显示细胞-细胞紧密连接上调,为上皮提供屏障功能,提示存在抵抗免疫细胞浸润的物理屏障。


FaSq肿瘤独特且主要包含胸腺(21)和甲状腺(13)SCCs,以及少量乳腺(4)、阴道(3)、皮肤(3)和胰腺(2)SCCs,其特征在于多种脂肪酸相关途径的上调,包括水溶性维生素的代谢、线粒体蛋白质输入、线粒体脂肪酸β氧化和脂肪酸代谢。作为罕见SCCs的子集,FaSq肿瘤可能更多地依赖脂肪酸作为膜形成、能量储存和信号分子产生的细胞构建模块,并且靶向脂肪酸代谢可能对这种SCCs亚型更具选择性(图5b)。


粒细胞浸润反映了宿主的炎症状态。SCCs的三个亚组分别以嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞炎症为特征。BaSq肿瘤,包括阴茎(18)、胆囊(18)、胰腺(15)、肺(6)、会阴(4)、皮肤(4)、口腔(4)、膀胱(1)和乳腺(1) SCCs,其特征在于嗜碱性粒细胞的高度富集,以及涉及KRAS信号上调、胰岛素加工、PDGF信号和缺氧的上调途径。NeSq肿瘤,包括妇科(18例阴道和21例宫颈病例)、乳腺(13例)、肺(13例)、食管(7例)、口腔(7例)、阴茎(4例)和胆囊(1例)SCCs,富含mv内皮细胞、ly内皮细胞和中性粒细胞。蛋白质组学分析显示上调的途径涉及DNA双链断裂修复、NOTCH信号通路、细胞周期和凋亡。EoSq肿瘤,包含会阴(14)和咽喉(20)SCCs,富含嗜酸性粒细胞、MSC和NKT细胞,涉及HSP90伴侣循环、雌激素反应延迟、自噬调节和紫外线反应上调(图5b)。多项研究表明,在各种类型的鳞状细胞癌中,包括口腔鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、鼻咽鳞状细胞癌和阴茎癌,肿瘤相关组织嗜酸性粒细胞增多的预后有所改善。


IhSq肿瘤,包括20例鼻咽鳞状细胞癌和1例会阴鳞状细胞癌,与其他5种亚型的区别在于它们对高度B细胞、CD4+T细胞和M1巨噬细胞具有更强的标记。该蛋白质组的特征在于多个致癌、免疫相关和信号传导途径的上调,包括KIT信号传导、B细胞受体信号传导、干扰素γ应答和氧化磷酸化的调节,因此可能受益于免疫疗法(图5b)。


TME效应不仅在肿瘤进展中起重要作用,而且也是通过靶向非肿瘤基质细胞或肿瘤细胞与基质细胞之间的相互作用来寻找治疗方案的潜在宝库。为了检查这些亚型在指导治疗选择中的效用,考虑了每个亚组中的可药物性(药物库版本5.1.5)和表达优势,并为每个亚组发现了相当多的药物靶点(图5e)。此外,由于微环境靶向策略主要包括抑制细胞外相互作用,因此总结了可靶向的肿瘤细胞上的膜蛋白(图5e,基因以粗体显示)。离子通道是癌症靶向治疗颇具吸引力的工具,在5种亚型中发现了离子通道药物靶点,包括钠通道(ClSq中的SCN4B和IhSq中的SCN5A)、钾电压门控通道(BaSq中的KCNQ4、NeSq中的KCNA5和IhSq中的KCND2)以及电压依赖性钙通道(FaSq中的CACNA2D2和IhSq中的CAC1E)。溶质载体(SLC)家族转运体利用电化学电位差或离子梯度来运送其底物穿过生物膜,可以是治疗的靶向。发现SLC16A7 (BaSq)、SLC6A9 (NeSq)、SLC7A2 (EoSq)和SLC12A1 (IhSq)在四种亚型中特异性表达,可作为某些亚型的治疗靶点。PDE3B参与脂肪酸代谢,可以是FaSq中的药物靶点(图5e)。基于这些观察结果,似乎有必要采用评估TME特性的方法进行治疗选择。


    

图5 基于免疫的pan-SCCs亚型


6人乳头瘤病毒相关SCCs的特征

为了更好地描述人乳头瘤病毒对部分SCCs的影响,检测了15种高风险人乳头瘤病毒类型,包括所有病例的16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和82。在333个核心组肿瘤中,只有肛门与生殖器SCCs有人乳头瘤病毒阳性患者,包括肛门(感染率100%)、阴茎(50%)、会阴(70%)、子宫颈(95%)和阴道(95%)(图6a)。


HPV16是肛门与生殖器SCCs患者的主要类型,阳性率高于54%(图6b),而HPV18 (6.67%)不像西方国家那样流行(~25%)。据报告,HPV18在低角质化SCCs和腺癌中富集,这可能是我国队列感染率低的原因。子宫颈和阴道通常被一个以上的人乳头瘤病毒分支感染,可能是由于它们的生理位置和高感染亲和力。然而,多重人乳头瘤病毒感染可能会影响人乳头瘤病毒疫苗的保护。如报告所述,一些持续性人乳头瘤病毒感染和病毒癌基因E6-和E7-表达使TP53和RB67失活。发现p53在肛门、子宫颈和阴道SCC中完全失去表达。与非原始SCCs相比,肛门与生殖器SCCs的RB表达水平较低。RB在这5种肛门与生殖器SCCs中表达存在差异,宫颈SCCs在这5种肛门与生殖器SCCs中表达最低。有趣的是,在宫颈SCCs中发现了负相关趋势。CDKN2A在人乳头瘤病毒阳性会阴SCCs中的表达高于人乳头瘤病毒阴性会阴SCCs(图6b)。


为了进一步阐明与其他类型或阴性SCCs相比,在HPV16感染的SCCs中差异激活或失活的分子途径,根据人乳头瘤病毒感染模式将这些肛门与生殖器SCCs分组(图6c)。第1组,仅HPV16感染;第2组,多重感染,以HPV16型为主;第3组,多重感染,HPV16不是主要类型;第4组,人乳头瘤病毒感染而非HPV16第五组,阴性。在这5组之间鉴定了8种差异途径调节模式(图6d)。在人乳头瘤病毒阳性的SCCs中,包括IP2、IP和INS的合成、核苷酸二和三磷酸的相互转化、蛋白酶体和DNA双链断裂反应在内的途径更高,表明高代谢环境。值得注意的是,HPV阴性SCCs与嗜碱性粒细胞亚型有相当大的重叠,其显著特征是KRAS信号升高(图6d)。组1-3的HPV16阳性SCCs显示更高水平的肌醇磷酸分解代谢过程和宿主对病毒转录的正调节,这意味着HPV16感染的细胞更依赖于肌醇磷酸代谢。同时,HPV16阳性SCCs对抗原受体介导的信号通路和T细胞受体信号通路均有负调节,揭示了HPV16感染引起的免疫抑制。相反,白细胞介素6介导的信号通路在HPV16阳性肿瘤中较低,连同PTK6调节RHO GTPase RAS GTPase和MAP激酶,ERBB信号通路的正调节,和离子通道活性(图6d)。接下来重点研究了多重人乳头瘤病毒感染(包括HPV16,组2-3)对细胞信号传导的影响。与人乳头瘤病毒阳性SCCs(第1-3组)相似,一些代谢途径高于其他3组。此外发现在多重人乳头瘤病毒感染的SCCs中,胰岛素样生长因子受体信号通路、失巢凋亡的负调控和对抗原刺激的炎症反应更高。离子门控通道活性在其他三组中较高,这与非HPV16感染的肿瘤相似(图6d)。最后,包括病毒潜伏期、成纤维细胞生长因子结合、TGFb途径的途径在作为主要类型SCCs的HPV16感染中较高,其中白细胞介素1分泌的正调节、上皮的形态发生的正调节和atrbrca途径较低(图6d)。


T细胞受体信号通路负调控蛋白LGALS3、EZR、PHPT1和PAWR在1-4组中升高,DUSP3仅在2-3组中升高(图6e)。参与磷酸肌醇分解代谢过程的INPP1在1-4组升高,NUDT3在1-3组升高(图6e)。在补充图10e中,将非生殖器SCCs的肌醇磷酸盐分解代谢过程中分子的蛋白质丰度与生殖器SCCs进行了比较。与生殖器SCC的第1-3组相比,INPP1和IMPA2在非生殖器SCCs中的表达较低。NUDT3表现出相反的表达模式,因为它介导磷酸盐降解,在非肛门生殖器SCCs中表达较高。INPP1在第1组肛门、阴茎SCCs中显示高表达。因此,这些分析表明,HPV16感染可能导致活性磷酸肌醇分解代谢过程和免疫逃避(图6f),参与HPV16 + SCC致癌作用。


    

Fig.6 人乳头瘤病毒相关SCCs的蛋白特征


7肿瘤标志物的性能

SCCs的有效管理应包括可靠的检测生物标志物和合理设计的预防和治疗药物。我们假设,来自深度蛋白质组分析的信息内容将足够丰富,可以高精度预测肿瘤起源部位。我们开发了一个基于机器学习的方法,以确定蛋白质组表达的能力,从而为SCCs患者的诊断提供信息(图7a)。在249名患者的训练集中,基于10倍交叉验证,准确预测了所有患者的诊断性SCCs类型(敏感性和特异性均为100%)。当用于84个样本的验证集时,模型的敏感性和特异性均达到100%(图7b)。


考虑到这些蛋白质组标记物可能具有来自不同细胞群的平均信号,使用pan-SCC队列中的患者,通过连续载玻片的免疫组织化学,在组织水平上检查了3种标记物PRKCE、SL27A1和CPXM2的空间表达(图7c,d;来自一个患者的同一组织连续)。此外将P63作为经典的pan-SCC标记物进行染色,将P16作为与人乳头瘤病毒感染相关的标记物进行染色,并进行EBER原位杂交(ISH)以标记EB病毒感染的细胞。P63染色显示这些SCCs组织总体呈阳性。EBER仅在鼻咽鳞状细胞癌中呈阳性。P16表达在人乳头瘤病毒感染阳性的宫颈和阴道SCCs中呈强阳性,而在人乳头瘤病毒阴性的ESCC和胸腺SCCs中呈阳性,如图7d所示,限制了其对人乳头瘤病毒阳性SCCs的诊断价值。


PRKCE在调节与细胞骨架蛋白相关的多种细胞过程中发挥重要作用,在离子通道调节中发挥功能,并参与癌细胞侵袭和凋亡调节。PRKCE的免疫染色在17个SCCs中显著不同,并显示在宫颈和阴道SCCs中总体高表达(图7d)。SLC27A1通过介导长链脂肪酸在质膜上的转运来介导长链脂肪酸进入细胞的ATP依赖性输入,并作为长链和极长链脂肪酸的酰基辅酶a连接酶活性。根据蛋白质组数据,SLC27A1在鼻咽、胆囊和胰腺SCCs中高表达。一致地,我们注意到在胆囊和胰腺SCCs中高比例的肿瘤特异性阳性SLC27A1染色(图7d)。SLC27A1的免疫染色鉴定鼻咽和肺的正常上皮细胞显示阳性染色,而不是SCCs细胞。CPXM2与发育性疾病相关,并被报道为胃癌、骨肉瘤进展和肝细胞癌中不利的预后标志。在这项研究中,我们发现CPXM2 IHC染色与蛋白质组学数据一致,在胸腺SCCs中高度表达(图7d)。这些结果强调了结合蛋白质组学和病理学来探索癌症类型特异性生物标志物的潜力。


    

Fig.7 肿瘤标志物性能及诊断标志物验证


实验结论

总之,本研究目前的工作利用蛋白质组学平台对pan-SCCs进行了系统和全面的分析。这些结果为复杂的工作增添了一个维度的信息,这可能对更好地理解SCCs具有重要意义。


科研延伸

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