AAV稳转案例｜10L向50/200L悬浮体系放大

2023-04-06 10:51:33, 颇尔生物技术颇尔（中国）有限公司

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去年，全球生命科学领域的先行者 Cytiva 收购了德国领先的高性能细胞系开发和病毒载体生产技术供应商 CEVEC 制药有限公司。腺相关病毒 (AAV) 用于递送基因治疗已经非常常见，但转染试剂和 DNA 的成本高昂，转染工艺的放大也面临着重重挑战，因此重组腺相关病毒 (rAAV) 治疗产品的产业化需要克服许多困难。CEVEC 的 ELEVECTA^®平台是一种稳定的细胞系，在实现可诱导式 AAV 生产的同时，无需任何昂贵的转染试剂，亦无需瞬时转染。

借助本研究，我们展示了：利用 AAV 生产细胞系，可实现从实验室级 10 L 生物反应器工艺放大至 50 L 和 200 L（即颇尔 Allegro^TMSTR 50 和 STR 200）生物反应器的载体生产；这为高达 2000 L（即颇尔 Allegro STR 2000）生物反应器的载体生产奠定了基础。我们还实现了良好的生产能力、产率以及可放大性，非常有利于下游工艺的初始单元操作，也有利于澄清收获以及切向流过滤。

作为 Allegro STR 生物反应器系列特性的一部分，颇尔开发了诸多模型来促进从其他生物反应器向 Allegro 系统的工艺转移以及生物反应器系列内部从 50 L 向 2000 L 的放大工艺。从 BioBLU 向其他生物反应器转移所用到的关键参数由生产商提供（表 1）。有了这些参数，便可利用上述 Allegro 系统模型，确定 Allegro STR 50 生物反应器的运行参数（表 1）。

用于计算 BioBLU 10c 和 Allegro STR 50 生物反应器系统之间等效工作参数的关键反应器特性:
生物反应器	叶轮直径 (mm)	工作体积 (L)	容器直径 (m)	未充气比功率数 (P0)
BioBLU 10c	91.8	10	0.204	0.38
Allegro STR 50	185	50	0.38	1.9

表1

许多方法可以实现从一个系统到另一个系统的工艺转移，其中最常用的方法是保证必要的体积输入功率、叶端速度、表面通气速率、VVM 或者 k_La。由于设计差异，不可能保证系统间的所有这些可变参数完全相同，因此最终有必要确定转移所需的参数子集。基于对不同规模 Allegro STR 生物反应器进行特性研究获得的数据，我们决定保证体积输入功率和表面通气速率恒定，以确保在不同的系统中实现类似的混合和传质。

BioBLU 10c 工艺运行时的搅拌速度为 200 rpm，气流速率保持恒定，为 0.2 L/min。在 BioBLU 10c 中，工艺的体积输入功率和表面通气速率恒定（表 2）。基于这些值，我们计算出了 Allegro STR 50 生物反应器运行时应具有的搅拌转速和分布器气流速率，分别为 128 rpm 和 0.8 L/min。同时，还计算了可用于转移的其他参数（表 2）。

在保持体积输入功率和表面通气速率恒定的条件下，计算得出的生物反应器间工艺转移所涉及的关键参数。
Parameter	BioBlu 10c	Allegro STR 50
体积输入功率 (W/m³)*	80	80
表面通气速率 (m/s)*	0.1	0.1
振摇速度 (rpm)	200	128
分布器气流速率 (L/min)	0.2	0.8
k_La 2080 (/h)	3	2.5
尖端速度 (m/s)	1	1.2
VVM	0.02	0.02
柯尔莫哥洛夫尺度 (µm)	58.4	58.3
k_La 2080 在 20％至 80％的溶解氧之间测定。 *在工艺转移过程中保持恒定的参数。

表2

确定了所需的工作参数后，先在 BioBLU 10c 中运行相应过程，然后在 Allegro STR 50 生物反应器中运行。对于 BioBLU 10c，直接从摇瓶培养物接种成了最终的工作体积（按 1:5 的比例稀释）。对于 Allegro STR 50 生物反应器，为减少所需摇瓶的数量，反应器在 12.5 L 的较小初始体积下运行，以产生足够的细胞。当活细胞浓度 >4 x 10⁵个细胞/mL 时，我们将生物反应器排放至 9.7 L，并将培养液按 1:5 的比例稀释至最终工作体积，以达到所需的接种密度。

Allegro STR 50 中细胞的诱导前比生长速率高于 BioBLU 10c 的生长速率，二者分别为 0.025/h 和 0.021/h。Allegro STR 50 生物反应器中实现的最大活细胞浓度也比 BioBLU 10c 生物反应器的浓度高，二者分别为 6.3 x 10⁶ 个细胞/mL 和 4.8 x 10⁶ 个细胞/mL（图 1）。不过，二者的总体情况十分相似，即诱导后 24 h 时生长停止，随后剩余细胞的活力下降。BioBLU 10c 中的生长情况与之前在 CEVEC 获得的情况相似，这表明相应过程正在按预期进行。两个生物反应器系统之所以存在生长速率差异，很可能是因为接种策略不同：BioBLU 10c 直接从摇瓶中接种，而 Allegro STR 50 生物反应器增加了一个在反应器内扩增接种的步骤，然后再以最终体积生长。这一点可以从 Allegro STR 50 生物反应器中初始接种物扩增阶段的比生长速率看出，该生长速率与 BioBLU 10c 0.020/h 的生长速率近似（数据未示出）。

图1：BioBLU 10c和Allegro STR 50培养物的细胞生长和活性曲线

从诱导后 2 天到诱导后 6 天（最终收获），通过 qPCR 测定了上清液和整个裂解细胞悬液的病毒基因组浓度（图 2）。与裂解细胞悬液相比，上清液所含病毒量随培养的持续而增加，到第 6 天，甚至几乎所有的病毒都进入到了上清液中。在两种规模上，实现了相似的病毒基因组产率：在收获时，BioBLU 10c 实验室级工艺上清液的病毒产率为 5.5 x 10¹³ vg/L（SD 1.26 x 10¹⁰，四次重复检测），Allegro STR 50 培养物的产率则为 4.6 x 10¹³ vg/L（SD 1.26 x 10¹⁰，四次重复检测）。

图2：诱导AAV产生后，借助生物反应器培养物的qPCR测定了病毒基因组的滴度，误差条代表标准偏差(重复检测)

成功实现从 BioBLU 10c 向 Allegro STR 50 生物反应器转移后，还以相同条件额外运行了一个 Allegro STR 50 生物反应器，以在工艺放大前确认可重现性。两次 Allegro STR 50 运行的细胞生长和活性曲线相似（图 3），病毒滴度也相当（图 4）。因此，结果证实 AAV 生产工艺具有可重现性。然后，再将该工艺放大至 200 L。

图3：50L和200L Allegro STR培养物的生长和活率曲线

图4：在生物反应器培养的第6天借助qPCR测定的收获AAV滴度，误差条代表标准偏差(重复检测)

为实现从 Allegro STR 50 向 Allegro STR 200 生物反应器的工艺放大，我们继续沿用了相同的技术转移参数，即体积输入功率和表面通气速率。然后，我们计算出了 Allegro STR 200 生物反应器运行时应具有的搅拌转速和分布器气流速率，分别为 96 rpm 和 2.1 L/min。同时，还计算了可用于工艺放大的其他参数（表 3）。

在保持体积输入功率和表面气速率一定的条件下，计算得出的扩展所涉及的关键参数。
参数	Allegro STR 50	Allegro STR 200
每体积输入功率 (W/m³)*	80	80
Super gas velocity(m/s)	0.1	0.1
Agitation speed(rpm)	128	96
Sparger air flow rate(L/min)	0.8	2.1
k_La 2080(/h)	2.5	2.5
Tip speed(m/s)	1.2	1.5
VVM	0.02	0.01
Komogorov length(μm)	58.3	58.3
*保持恒定的参数。

表3

为得到足够的细胞以便接种 Allegro STR 200 生物反应器，我们以前述相同参数运行了 Allegro STR 50 生物反应器，以进行细胞扩增。然后，直接利用 STR 50 L 接种 200 L 生物反应器，以达到最终工作体积。

两次 Allegro STR 200 生物反应器运行的生长曲线，与在两次 50 L 运行中观察到的趋势相同。第二次 STR 200 运行接种在目标范围的顶部，并增长至略高的细胞浓度（图 3）。总之，就细胞生长和存活能力而言，我们认为放大是成功的。

图 4 示出了在诱导后第 6 天，借助 qPCR 测定的所有生物反应器上清液和整个裂解细胞悬液的收获病毒基因组滴度。可以看出，工艺放大良好——在所有规模上实现了类似的病毒基因组产率。原 BioBLU 10c 实验室级工艺上清液的产率为 5.5 x 10¹³vg/L（n=1 个生物反应器），而 Allegro STR 50 培养物的平均产率为 6.2 x 10¹³ vg/L（n=2 个生物反应器），Allegro STR 200 培养物的产率为 5.7 x 10¹³ vg/L（n=2 个生物反应器）。

关于哺乳动物细胞培养工艺的放大，其中一个问题在于：当工艺以较大的工作体积运行时，培养物中会有 CO₂ 累积。但是，Allegro STR 50 和 STR 200 培养物却遵循了相似的 CO₂ 变化规律（即不再受工艺规模影响），未见证据。