技术控 | 离子对反相分析合成寡核苷酸的流动相优化

寡核苷酸复杂的合成和降解途径涉及复杂的新化学修饰，会产生数百种杂质，而传统的小API通常仅包含约三到五个明确的杂质。

⼤多数寡核苷酸是通过固相合成制造的，其中逐步添加核苷酸，从⽽表征通常相关的n-1和n+1杂质。然⽽，即使使⽤离⼦对促进分析分离，要全⾯表征合成寡核苷酸的⼯艺和产品相关杂质，还需要进⾏⼴泛的⽅法开发和流动相优化。

所有治疗性寡核苷酸在进入体内之前必须经过化学修饰。其中一种修饰是硫代磷酸酯（PS）修饰，它会产生非对映异构体：对于20核苷酸长的PS寡核苷酸，这超过了五十万个非对映异构体。

（a）经典小API分子奥美拉唑和（b）典型治疗性寡核苷酸产物的质量控制色谱图示例

已经开发出多种分析分离方法来检测和定量寡核苷酸的产品相关杂质。过去，用于测定n-1杂质水平的基于长度的分离是使用毛细管凝胶电泳进行的，例如，强阴离子交换（SAX）色谱被广泛用于分离PS修饰寡核苷酸的磷酸二酯产物相关杂质。如今，基于反相液相色谱（RPLC）模式的离子对色谱（IPC）是分析分离寡核苷酸的主要分离模式。但也有其他有用的方法，例如离子交换色谱（IEX），毛细管电泳，新的操作模式显示出有希望的结果，例如基于混合相模式和亲水作用色谱的分离。

在IPC中，最常见的离子对试剂（IPR）是叔烷基胺，如三乙基乙酸铵（TEtAA）和三丁基乙酸铵TBuAA。高分辨率反相具有与质谱直接兼容的额外优点，尽管存在信号抑制问题。添加氟醇的烷基胺是用于提高质谱灵敏度的最常见流动相组分。事实上，当与电喷雾电离质谱（ESI-MS）检测器结合使用时，IP-RP HPLC（以下简称“IPC”）使用含有5–20mM烷基胺的流动相，添加或不添加氟醇，现在被认为是检测和定量寡核苷酸药物产品相关杂质的极其强大的方法。

最近这篇综述介绍了使用硅基固定相颗粒进行分析和小规模制备分离，将简要讨论有机聚合物颗粒在大规模纯化中的使用。基于表面化学、粒径、孔径以及选择最佳流动相组成、梯度组成和类型等最重要的操作/实验参数（例如，选择合适的固定相）的理论综述以及影响。

我们知道，除了烷基胺离子对外，还会使用酸性改性剂来缓冲流动相，并确保LC条件更适合需要高温才能进行适当LC分离的寡核苷酸。具有乙腈梯度的醋酸三乙铵缓冲液最常用于DMT‑（即未保护的）寡核苷酸的LC纯化。然而，醋酸铵已被证明对寡核苷酸的电离效率是有影响的。Gilar及其同事的开创性工作也证明了使用六氟异丙醇（HFIP）提高TEA离子对效率的优势。HFIP具有沸点为58.2°C，在液滴形成过程中，pH值随着TEA或其他烷基胺向水提供质子而降低。这有助于寡核苷酸在进入气相时在液滴表面带上负电荷。

上图显⽰了20mer硫代磷酸酯，⽐较电荷包络与不同烷基胺离⼦对-三⼄胺（底部）和⼰胺（顶部）的归⼀化光 谱。⼰胺导致更宽的电荷态分布，这可能是由于对寡核苷酸的任何分⼦内相互作⽤的影响最⼩，从⽽降低了电荷态。电荷态分布的转变可能有助于提⾼⽅法特异性或简化表征光谱。

也就是说，如上图所⽰，TEA的浓度对整体电荷包络⼏乎没有影响；即使⾼达16mM，电荷包络仍限制在-9到-7之间。越疏⽔的HA产⽣越多的低电荷态。同样，这可能有助于提⾼MS⽅法的灵敏度和/或特异性。因此，如果⽬的是调节电荷包络以提⾼特异性或简化光谱，则疏⽔性更强的烷基胺（如HA或⾟胺）可能是有利的。

该类型的烷基胺可能具有的其他影响是对阳离⼦加合物的形成。钠和钾等碱⾦属被寡核苷酸的带负电荷的磷酸⼆酯和硫代磷酸酯主链吸引，对ESI灵敏度产⽣负⾯影响。

使⽤不同浓度的离⼦对（蓝⾊-1mM TEA，灰⾊-16mM TEA）对硫代磷酸酯进⾏LC-MS分析的解卷积谱图⽐较。观察到钾离⼦的阳离⼦加合显着减少（15x）（7164.6Da解卷积质量）。还观察到钠/钾加合物（7188.8Da解卷积质量）的减少。

关于离⼦对的最后⼀点是，应该对单链寡核苷酸和双链寡核苷酸进⾏⼀些考虑。⼀般⽽⾔，更疏⽔的烷基胺对于改善⾊谱和电离特异性（即较低的电荷状态）是最佳的，但是，对于双链寡核苷酸，还应考虑⼀些额外的因素。

上图显⽰了使⽤TEA作为离⼦对试剂的21mer双链RNA。使⽤12.5mM HFIP的浓度和每柱体积约1%B的合理浅梯度。相对低浓度的4mM TEA提供了⾜够的siRNA 保留，具有良好的正义和反义链分辨率。

使⽤DIEA分离双链RNA；运⾏条件相同。虽然较早洗脱的杂质可能有⼀些分离，但进样的分离并不⼀致。这可能表明这些不是杂质，⽽是由于核酸保持其⼆级结构⽽导致的层析异常。

使⽤疏⽔性更强的离⼦对试剂（DIEA）分离双链RNA会产⽣错误结果。尽管由于许多较早洗脱的杂质，分离效果似乎有所改善，但该结果不可重复。

此外，更多的疏⽔性离⼦对试剂产⽣更差的⾊谱，类似于双链寡核苷酸的分析，因此，使⽤三⼄胺调节浓度和优化梯度程序可能是双链核酸需更谨慎考虑的⽅法。

如前所述，HFIP⽤作寡核苷酸LC-MS分析的酸性修饰剂，并促进电离，从⽽在质量中产⽣更好的信号。

然⽽，使⽤相对较⾼的浓度（100-400mM或1-4%）主要是为了提⾼离⼦对效率。由于烷基胺在HFIP和其他全氟醇中的溶解度极⼩，烷基胺更有效地促进了极性寡核苷酸的疏⽔保留。由于现在的杂化硅胶颗粒⽐第⼀代pH更稳定，更疏⽔，因此可能不需要400mM HFIP（基本上是可溶于⽔性缓冲液的最⾼浓度）。此外，由于离⼦对的增加通常会产⽣更好的⾊谱和光谱数据，HFIP的减少将允许更⾼的浓度和/或不同类型的烷基胺。尽管如此，由于HFIP对ESI液滴解吸⾄关重要，因此仍然需要最⼩量。

在探索酸性改性剂最佳浓度的实验中，我们看到较低的HFIP通常可以更好地分离较早洗脱的杂质，并提供总体上更好的峰形和峰⾼。这有点反常规，因为总体保留的降低通常会对⾊谱产⽣不利影响。将HFIP从100mM降低到25mM HFIP显⽰siRNA互补链的分离得到改善，分辨率从25降低到12.5mM。不论⻓度、化学修饰和硫代作⽤如何，在多个寡核苷酸样品上都观察到了这种效果。

BNA硫代磷酸酯寡核苷酸的LC-UV⾊谱图（260nm），红⾊-100mM HFIP，蓝⾊-12.5mM HFIP。对分离的影响不⼤，峰前分离略有改善。

尽管在某些情况下⾮常显着，分离和杂质分布相对相似。尽管LC-UV的BNA杂质谱可能没有显⽰出明显的改善。

BNA硫代磷酸酯电离效率的影响，TOF-MS（粉⾊-12.5mM，蓝⾊-100mM）。较低浓度HFIP的峰⾼为3.6e7，对于100mM，峰⾼为1.8e7。