布鲁克联手Biognosys公司带来血样蛋白高通量靶向分析,加速临床研究转化!

2023-03-16 13:14:40, 4D-组学老虎队 布鲁克(北京)科技有限公司-质谱仪器


-APPLICATION NOTE-


背景介绍



作为常见易得的一种临床样本,血液是疾病机理研究和生物标志物研究理想的研究对象之一。然而,基于质谱进行血液蛋白质组分析存在诸多困难,血液样本中表达蛋白丰度动态范围大,高低丰度蛋白的差异超过10个数量级,而且从质量上看,为数不多的高丰度蛋白质占血浆总蛋白量的90%以上【1】。常用解决方法就是使用抗体去除其中的高丰度蛋白来实现低丰度蛋白的检测,但是去除高丰度蛋白的策略不仅需要额外的时间和成本,而且部分高丰度蛋白会与其他蛋白形成复合物,导致在去除高丰度蛋白的同时损失了这部分信息,影响定量。在大队列生物标志物发现的研究中,除了需要实现对低丰度蛋白的覆盖,更强调数据的可重复性和低CV值,来支持临床分析和诊断【2】。因此,血浆分析对样品的前处理和质谱仪器的检测速度、灵敏度和稳定性都提出了更高的要求。 

布鲁克在2022第70届ASMS会议上推出的最新款timsTOF系列质谱产品timsTOF HT,它配备了第四代拥有更高离子容量的TIMS分析器TIMS-XR和更先进的数模转换器,具有超高灵敏度(离子在淌度管内实现时间和空间上的聚焦)以及超过150Hz的二级扫描速度,可实现更宽的动态范围、更深的肽段覆盖率和更准确可靠的定量分析。timsTOF HT不仅充分支持CCS,而且还支持所有基于PASEF®技术的采集模式,包括dda-PASEF、dia-PASEF®【3】和prm-PASEF®【4】,在血浆蛋白质组、组织蛋白质组和表观蛋白质组学中都具有出色的表现。



#实验部分#

本次研究在不去除高丰度蛋白的基础上,结合iST样品酶解试剂盒进行血浆样本前处理,后续利用PQ500试剂盒对血浆蛋白进行靶向定量,减少繁琐耗时的前处理流程,实现高重复性和高通量血浆样本蛋白质组分析。首先收集10例健康和10例肺癌血浆样本,使用iST样品酶解试剂盒(PreOmics公司)对血浆样本进行样本前处理,再通过PQ500试剂盒(Biognosys公司)对血浆蛋白质进行绝对定量分析。实验在布鲁克纳升液相nanoElute和全新4D质谱平台timsTOF HT上完成,采用30分钟色谱梯度结合4D dia-PASEF®技术,对血浆样本进行数据采集。数据后续在Spectronaut上进行分析,使用Spectronaut中默认的PQ500数据库(包含目标数据提取的离子迁移率注释)进行蛋白数据库搜库,实验流程见图1。

图1.

4D dia-PASEF+ PQ500:血样蛋白靶向定量分析流程



#实验结果#

1.

非标记定量性能验证

为了评估该方法的非标定量性能,在未去除高丰度蛋白的人血浆样本中添加了两种不同浓度的PQ500 肽段,结果(图2)表明在整个动态范围内可以实现准确定量,测得比率(1:1.98(± 0.15))与理论比率(1:2)基本一致。同时CV中位值为7.3%,90%的PQ500 SIS肽段的CV值小于20%,证明该方法具有非常好的稳定性和重现性。

图2.

未去除高丰度蛋白的人血浆样本中添加不同浓度PQ500鉴定多肽分布图


2.

靶向定量检测

在未去除高丰度蛋白的肺癌患者血浆样本的定量分析中,采用dia-PASEF技术可以检测到PQ500 panel中804个SIS标肽,对应578个蛋白(图3)。同时,加入同样浓度的PQ500,20例样本对应鉴定到的肽段和蛋白数量差异非常小,证明仪器良好稳定性。

图3. PQ500 panel中鉴定到的SIS肽段和蛋白的数量

由于样本来自20例不同的个体,个体差异导致样本中的内源性肽段和蛋白差异更明显,因此不同样本中共鉴定出663条内源性肽段,对应463个蛋白,覆盖约80%的PQ500 panel(图4)。

图4.

PQ500 panel中鉴定到的内源性肽段和蛋白的数量

实验结果(图5)表明,在健康和肺癌两个组别中共有55个显著差异蛋白(p<0.05, fold change>2),除了纤维连接蛋白、免疫球蛋白lambda样肽1 和免疫球蛋白lambda样肽1 轻链在健康组样本中含量更高以外,其余蛋白在肺癌组中均表现为显著上调,如C- 反应蛋白/CRP(一种已知在患者中上调的炎症标记物)、S100蛋白家族(细胞内Ca2+传感器,参与肺癌在内的多种恶性肿瘤的发病机制【5】)以及血清淀粉样蛋白A/SAA,在肺癌患者中观察到显著上调,这也在之前的研究中已有相关报道【6】

图5.

PQ500 panel中差异显著蛋白分布火山图


3.

非标定量分析

dia-PASEF+PQ500分析流程不仅可以对靶向肽段进行检测,而且可以获得所有鉴定肽段的定量信息。通过Spectronaut软件,在无需通过分馏分建库的条件下,使用direct-DIA进行数据处理可以同时鉴定和定量非靶向肽段。实验结果(图6A)显示,共鉴定到543个蛋白和4540个肽段,另外在靶向定量肽段的基础上,又发现了26个差异蛋白(p<0.05,fold change>2)(图6B)。与健康组相比,细胞外超氧化物歧化酶(SOD3)在肺癌患者中表达更高。已知SOD3在肿瘤细胞中的表达比在正常细胞中表达得更高,其水平已被用于提供有关患病患者存活率的信息【7】

图7.

direct-DIA蛋白分析结果。(A)鉴定蛋白和肽段的鉴定数;(B)非标记定量蛋白差异分析



#结论#

本研究评估了dia-PASEF技术结合PQ500 试剂盒(由 804 种稳定同位素合成肽段组成,可对血浆中的五百多种蛋白质进行可靠的靶向定量),在对未去除高丰度蛋白的血浆样本进行高通量靶向定量分析中的性能表现。

1.

该方法既解决了靶向工作流程操作繁琐且耗时的问题,同时保证了出色的靶向定量结果;

2.

dia-PASEF 技术可在 30 min梯度内覆盖PQ500 panel中全部的580多种蛋白;

3.

dia-PASEF技术不仅可以对PQ500中的蛋白进行靶向定量,而且可以实现对其它蛋白的定性定量分析,同步实现靶向蛋白质组学分析和生物标志物发现;

4.

该工作流程已应用于肺癌研究,发现与肺癌相关蛋白,证实了该方法应用于临床研究的潜力。



#参考文献#

[1] Anderson et.al. (2002), Mol. Cell Proteomics, Nov;1(11):845-867 [2] Vera et.al. (2019), J. Proteomic Res., Oct;18(12):4085-4097

[3] Meier et.al. (2020), Nat Methods, Dec;17(12):1229-1236

[4] Lesur et.al. (2021), Anal. Chem, Dec; 93 (3), 1383-1392

[5] Wang et al. (2021), Clin Chim Acta., Sep; 520:67-70

[6] Kim et al. (2015), Proteomics, Sep; 15(18):3116-312

[7] Zhang et al. (2022), Front Oncol.; 12:722646.


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