标签蛋白纯化之MBP篇

2023-03-23 14:20:55, Wang Cheng Yi

1982年，世界上第一款重组蛋白药物—重组人胰岛素上市，敲开了重组蛋白药物发展的大门。重组蛋白通过人工重塑后的DNA和RNA产生，与天然的蛋白或小分子药物相比，它的特异性更强，功能更加明确，并且尽可能地减小了毒性与副作用，已经越来越受到行业的重视。近年来，有关重组蛋白的纯化技术与产品也日渐丰富。其中，在蛋白上融合具有特异性亲和能力的标签分子，并用于纯化和检测，已经成为了一种非常广泛的方法。

Cytiva作为全球纯化领域的先行者，在标签蛋白纯化领域拥有种类齐全、品质高端的产品族群。今天，我们将为大家带来MBP标签亲和层析的解决方案。

图1：标签蛋白亲和层析：标签与填料发生特异性结合，通过改变缓冲液条件，将结合分子洗脱

关于MBP标签

MBP即麦芽糖结合蛋白 (maltose binding protein) ，由346个氨基酸残基构成，分子量较大，约42 kD，由大肠杆菌K12的malE基因编码。此外，MBP的折叠过程需要DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES两个分子伴侣系统的帮助，而这些分子伴侣也会聚集在目标蛋白的附近，帮助它们正确折叠，并增加目标蛋白的可溶性。所以，MBP标签是一种非常受到青睐的标签。MBP可以与含有葡聚糖配基的填料特异性结合，达到快速、高效的捕获与纯化目的。

表1：常见标签类型及特点

	GST	MBP	Strep	His
大小	26 KDa	40 KDa	8 AA	6 AA
填料载量	30 mg/ml	10 mg/ml	6 mg/mL	40 Mg/ml
纯度	26 KDa	40 KDa	8 AA	6 AA
促进溶解	26 KDa	40 KDa	8 AA	6 AA
去除标签	需要	需要	不需要	不需要
成本	中等	中等	高	低

MBP标签亲和层析产品

对于MBP标签的亲和层析，Cytiva也提供了专业、高质量的产品系列。包括了散装的Dextrin Sepharose High Performance填料以及MBPTrap HP预装柱产品。大量的使用经验表明，Cytiva的MBP亲和层析产品具有以下的优势：

高效率捕获MBP标签重组蛋白，纯化后的样品纯度高、浓度高、体积小

生理性的实验条件以及温和的洗脱方式，保持了目标蛋白的质量与活性

与常用的水基缓冲液兼容，并易于使用0.5 M NaOH进行再生

易于扩大规模

预包装的MBPTrap HP（1 mL和5 mL两种规格）层析柱，为客户提供便利，节省时间，并确保结果的可重复性

图2：Cytiva MBP标签亲和纯化产品系列

案例分享

案例1：在ÄKTAxpress上进行自动两步纯化法（标签亲和+凝胶过滤）

材料与方法：

表2：材料与方法

实验结果：

图3：实验结果，层析图谱与SDS-PAGE结果

结果如图3所示，将第一步亲和层析洗脱峰中的样品进行凝胶过滤层析，得到最终纯化样品，在SDS-PAGE得到的结果中可以看到，最终产物中已经几乎没有杂质（条带3）。整个实验经过两步纯化，得到目标蛋白2.2 mg，实验所用时间仅有3.4 h，保证纯度和产量的同时，极大地节约实验所需时间。

案例2：中链酰基CoA脱氢酶 (MCAD) 的纯化与功能研究

实验目的、步骤与材料：

MCAD是一种与代谢类型疾病相关的蛋白质，本实验中，要对其稳定性、折叠与动力学进行研究。在大肠杆菌裂解液中，收获了15 mg N端带有MBP标签的MCAD。首先，使用MBPTrap HP 5 mL预装柱进行捕获，收集洗脱样品，再进行凝胶过滤精纯，得到最终样品。

实验结果：

图4：层析图谱：(A) 亲和层析；(B) 凝胶过滤层析

图5：SDS-PAGE结果

两步层析实验的结果图谱如图4所示，SDS-PAGE结果如图5所示。在亲和层析实验中，不含有标签的杂质从层析柱中直接流穿，含有标签的样品结合到层析柱上，并随着麦芽糖溶液洗脱。从4—6条带可以看到，此时的样品中仍含有较多杂质，这是由于样品中含有表达不完整的变体，这些变体上同样带有MBP标签，被柱子捕获。再经过凝胶过滤后，样品的纯度大大提高，最终得到纯净的产物约8.4 mg。