Science | 朱平等揭示半胱氨酸羧乙基化修饰生成新生抗原诱导HLA限制性自身免疫反应

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是由人体内出现的新生自身抗原破坏免疫耐受，引发抗原特异性免疫反应，进而造成多器官损伤的疾病。翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）是一种能够改变蛋白结构和功能的生物学现象，或可诱导机体产生新生抗原（neoantigen）并引起相应的自身免疫反应。先前研究已经证实瓜氨酸修饰肽是类风湿关节炎自身免疫反应的重要来源【1】。然而，AS新生抗原形成和自身免疫反应的分子机制尚不明了，亟需研发一种系统方法，分析AS及其他自身免疫性疾病患者体内蛋白修饰谱，从中识别与自身反应性新生抗原产生相关的PTM，进一步加深对AS等自身免疫性疾病发病机制的理解。

2023年3月17日，空军军医大学朱平团队在Science发表题为“Cysteine carboxyethylation generates neoantigens to induce HLA-restricted autoimmunity”的长篇研究论文，首次发现并鉴定出一种全新的蛋白PTM——半胱氨酸羧基乙基化修饰。半胱氨酸与3-羟基丙酸（3-hydroxypropionate，3-HPA）结合形成硫醚键时，产生半胱氨酸羧乙基化修饰，该反应需要胱硫醚β合酶催化。其中整合素96位半胱氨酸（ITGA2B-96Cys）羧乙基化修饰，激活了溶酶体降解途径，产生羧乙基化ITGA2B修饰肽，增强了HLA-DR4复合物中该修饰肽的募集。经TCR克隆验证等多种方法证实，该修饰肽是CD4+ T细胞反应敏感的新生抗原，可引起HLA限制性自身免疫反应。该研究破解了AS自身免疫病发病分子新机制。

AS是一种自身免疫病，患者发病与人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen，HLA）分型有明显的相关性，如HLA-B27，HLA-DRB1等【2】。体内HLA可将抗原肽提呈至细胞表面，激活抗原特异性T/B淋巴细胞应答，促进自身抗体的产生。翻译后修饰或是AS体内新生抗原的重要来源。因此，论文作者开发了一种系统的开放搜索方法，用来识别蛋白中氨基酸残基和衍生物。这些氨基酸残基与基因组编码序列的翻译产物不同，是潜在的蛋白翻译后修饰形式。首先，通过开放式搜索方法识别AS患者蛋白组中可能的氨基酸衍生物，分析得到大量的非编码氨基酸（non-coded amino acids，ncAAs），修饰基团以质量偏移（deltamass or mass shifts）表示。

图1：强直性脊柱炎潜在蛋白翻译后修饰谱（Top 40）

其中，一种带有72.021 Da质量偏移的氨基酸衍生物与AS相关。进一步分析比较发生72.021 Da质量偏移的氨基酸残基，发现半胱氨酸携带的72.021 Da质量偏移呈正态分布，同时，AS患者72.021 Da修饰在ITGA2B 96位半胱氨酸位点高度富集。通过质谱及抗修饰抗体验证，72.021Da的质量偏移与C3H4O2的分子式相匹配，为半胱氨酸羧乙基化修饰。体内外实验表明，半胱氨酸羧乙基化修饰的代谢底物为3-HPA，该反应可在胱硫醚β合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）催化下进行。3-HPA是一种肠道微生物释放的代谢物【3】。

随后，将获得的AS疾病相关潜在修饰谱分析验证，从中筛选可能的AS相关PTM自身抗原（修饰型新生抗原），并研究修饰型新生抗原介导AS发病的机制。作者发现半胱氨酸羧基乙基化修饰诱导ITGA2B分子发生溶酶体途径降解，诱导主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）II依赖的CD4+ T细胞反应。荧光偏振和ELISA实验表明，半胱氨酸羧乙基化修饰肽（ITGA2B-ceC96）可作为新生抗原被MHC II复合物HLA-DRA*01/HLA-DRB1*04提呈至细胞膜表面。HLA-DRB1*04基因型患者产生新生抗原特异性自身抗体和T细胞应答，该反应与患者体内3-HPA水平存在相关性。3-HPA给药联合ITGA2B-ceC96抗原肽免疫HLA-DR4转基因小鼠，可诱导小鼠再现肠炎及脊柱病变。

总结来说，半胱氨酸羧乙基化修饰是体内代谢产物3-HPA引起的新型蛋白修饰形式，羧乙基化修饰的ITGA2B能够诱导AS产生修饰型新生抗原，发生特异性自身免疫反应。为攻克重大自身免疫病提供了“差异修饰蛋白—修饰型新生抗原”的系统方法策略。该研究首次揭示了自身免疫病“环境-代谢物-新修饰-新抗原”的致病新机制、新理论，为代谢物修饰形成新生抗原、诱发自身免疫病病因病理学研究奠定了至关重要的基础，并对建立AS等免疫病自身抗原特异性筛查和针对性治疗策略具有重大意义。

图2：半胱氨酸羧乙基化修饰生成新生抗原诱导HLA限制性自身免疫反应。

同期Science配发了专项评述：Autoimmunity to the modified self，评论特别指出大量翻译后修饰在炎症和代谢被监测到，自身蛋白PTM是自身免疫的重要来源，将有可能发现更多诱发自身免疫PTM。

空军军医大学朱平教授为论文通讯作者，郑州大学一附院杨静华教授和上海大学陈亮教授为论文共同通讯作者。空军军医大学翟月博士为论文第一作者。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abg2482

[1] Dong X, Zheng Z, Zhai Y, Zheng Y, Ding J, Jiang J, et al. ACPA mediates the interplay between innate and adaptive immunity in rheumatoid arthritis. Autoimmunity reviews. 2018;17:845-53.

[2] Reveille JD, Zhou X, Lee M, Weisman MH, Yi L, Gensler LS, et al. HLA class I and II alleles in susceptibility to ankylosing spondylitis. Annals of the rheumatic diseases. 2019;78:66-73.

[3] Nguyen-Vo TP, Liang Y, Sankaranarayanan M, Seol E, Chun AY, Ashok S, et al. Development of 3-hydroxypropionic-acid-tolerant strain of Escherichia coli W and role of minor global regulator yieP. Metabolic engineering. 2019;53:48-58.