【THUNDER小课堂】视网膜相互作用的可视化助力眼部疾病的研究

视网膜血管疾病是导致视力受损和失明的主因^[1]。大多数哺乳动物的视网膜由三层血管网络形成，其中包括两个视网膜内毛细血管床。在人体内，基因突变会引发家族性渗出性玻璃体视网膜病变（FEVR）、以及周边视网膜血管化不完整为特征的遗传性疾病、如诺里病、早产儿视网膜病变（ROP）或Coats病^[1]。患有这些疾病的视网膜血管都有所改变。科学家利用小鼠视网膜模型来研究视网膜中内皮细胞、血管、小胶质细胞和星形胶质细胞间的相互作用。利用整个视网膜制片来展示视网膜血管^[1]。固定并染色后，必须对整个视网膜进行高分辨率成像，以观察整个血管网络及单细胞相互作用。本文将展示如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture和Large Volume Computational Clearing（LVCC）高效地研究小鼠视网膜细胞间的相互作用^[2，3]。

如何对整个视网膜进行快速成像，并获得清晰的高对比度3D成像结果，展示重要细节对研究视网膜至关重要。视网膜成像一般使用共聚焦显微镜进行扫描，但是这种方法要花费数小时才能采集到整个视网膜图像。而常规的宽场显微虽然成像速度快，检测灵敏度高，但是对厚标本的成像，如整个视网膜，通常会出现非焦平面干扰导致模糊，降低对比度^[2，3]。

使用THUNDER Imager 3D Cell Culture仪器对整个视网膜进行成像。使用抗CD31抗体标记视网膜内皮细胞（黄色），使用IsoB4标记视网膜血管和小胶质细胞（品红色），并使用抗GFAP抗体标记星形胶质细胞（青色）。观察整个视网膜时，采用3个荧光通道，用20x Plan Apo 0.8 NA（数值孔径）物镜和100个视野拼接、厚度为15-μm进行 Z轴堆栈成像。

Large Volume Computational Clearing（LVCC）^[2，3]方法可清晰展示视网膜内的内皮细胞、小胶质细胞和星形细胞间的相互作用（见图1）。一般情况下，通过宽场显微镜很难观察到视网膜中的这些细胞。通过THUNDER Imager 3D Cell Culture进行高速采集，可在几分钟时间内采集到大约24 GB的整个视网膜成像。采用LAS X Navigator软件中焦平面矫正的方法，可以保证视网膜样本每一个位置都处于最佳焦平面。

图1：使用THUNDER Imager 3D Cell Culture整个视网膜制片的最大化投影图像：A) 宽场原始数据和 B) LVCC结果。插图所示为单个内皮细胞（黄色， CD31抗体）、血管和小胶质细胞（品红色，IsoB4）和星形细胞（青色， GFAP抗体）的宽场视图。图片来源：Jiyeon Lee博士和Jeremy Burton博士，Roche Genentech，美国加利福尼亚州南旧金山。