专家点评Cell Res丨李斌团队揭示蛋白质2-羟基异丁酰化调控RNA ac4C酰化修饰促进肿瘤转移的作用机制及干预策略

2023-03-09 10:30:55, BioArt

点评 | 赵英明（芝加哥大学）、李海涛（清华大学）、伊成器（北京大学）

蛋白质翻译后修饰（Protein post-Translational Modification，PTM）是一种重要的细胞调控机制。其中赖氨酸酰化修饰 (lysine acylation) 是指在酶催化下将酰基辅酶A (Acyl-CoA) 供体转移至蛋白质的赖氨酸侧链，进而改变蛋白的理化性质，在癌症等重大疾病的发生发展起关键作用【1, 2】。随着抗体富集技术的快速发展，不断有新的蛋白质酰化翻译后修饰类型被发现，例如赖氨酸丁酰化 (butyrylation, kbu) 、琥珀酰化 (succinylation，ksucc)、丙二酰化 (Malonylation, kma) 、巴豆酰化 (crotonylation, kcr)、2-羟基异丁酰化 (2-Hydroxyisobutyrylation, khib) 及β-羟基丁酰化（β-hydroxybutyrylation, kbhb）等【3, 4】。酰化修饰在人类生理和病理变化过程中发挥重要作用，然而这些新型翻译后修饰的研究仍处于起步阶段，相关的修饰/去修饰酶及其对底物分子的调控机制鲜有报道，是一个非常值得探讨的研究领域。Khib是一种高丰度的新型酰化修饰，已在多个物种中被发现，然而，khib 在肿瘤转移中的生物学功能未见报道，修饰酶和去修饰酶更有待进一步挖掘，值得深入研究。

作为蛋白质合成的信号来源，RNA本身也存在着不同的化学修饰，RNA修饰及相关调控蛋白的异常与人类重大疾病密切相关【5, 6】。N4位乙酰胞嘧啶（ac4C）是一种古老且保守的化学修饰，主要存在tRNA和18S rRNA上。该修饰提高mRNA的稳定性，并有助于翻译过程中正确读取密码子，有望成为表观遗传学新的发展方向【7】。N-乙酰转移酶10（NAT10）是目前哺乳动物中鉴定到唯一同时具有RNA结合结构域和乙酰酶结构域的蛋白，被认为是哺乳动物ac4C修饰酶。但是，NAT10本身是如何被调控的，仍不清楚。

2023年3月8日，广州医科大学附属第五医院李斌教授团队在Cell Research在线发表题目为 Lysine 2-hydroxyisobutyrylation of NAT10 promotes cancer metastasis in an ac4C-dependent manner 的最新研究成果。该研究首次揭示了蛋白质新型酰化修饰与RNA修饰之间紧密关联的动态调控网络，并阐明2-羟基异丁酰化修饰增强NAT10蛋白质稳定性进而促进NOTCH3 mRNA的ac4C修饰，最终导致肿瘤侵袭转移的分子机制，为解决肿瘤转移难题提供了新的理论基础及治疗思路。

在这项研究中，作者首先对多例食管癌患者的癌组织、癌旁组织及配对淋巴转移组织进行khib修饰蛋白质组学及全蛋白质组学质谱鉴定；结合生物信息学、功能筛选及位点特异性修饰抗体，发现NAT10第823位赖氨酸存在2-羟基异丁酰化修饰 (NAT10 K823-Khib)。Khib修饰是一个动态可逆的过程，为了寻找调控NAT10 K823-Khib的修饰酶和去修饰酶，作者结合免疫共沉淀和分子实验，发现KAT7介导了NAT10 K823-Khib 修饰。进一步分析发现KAT7在食管癌组织中呈现高表达且与NAT10 K823-Khib 呈正相关。用相同的策略，作者发现SIRT7是NAT10 K823-Khib 的去修饰酶。这些发现表明，NAT10 K823-Khib 的修饰水平由乙酰转移酶KAT7及去乙酰化酶SIRT7动态调控。

为了评估NAT10 khib修饰是否促进食管癌的侵袭转移，作者首先构建过表达或敲除NAT10基因的细胞模型，通过体外侵袭模型、体内爪垫淋巴转移模型及分子实验的深入验证，发现NAT10可以通过调控侵袭性伪足的形成促进食管癌细胞的侵袭转移。更为重要的是，当在NAT10敲除细胞中过表达模拟非khib修饰状态的NAT10 K823R并不能抵消敲除NAT10后对侵袭转移的抑制作用，证实NAT10 K823hib确实介导食管癌侵袭转移。

为了进一步解析NAT10/ac4C调控肿瘤侵袭转移的分子机制，作者在NAT10过表达细胞和对照细胞进行RNA-seq、acRIP-seq及化学方法基础上的单碱基分辨率定量ac4C测序【8】，通过生物信息学分析、分子实验鉴定到NOTCH3 mRNA ac4C的位点。NAT10的敲除显著降低NOTCH3 mRNA ac4C修饰水平，通过基因回补过表达NAT10野生型（NAT10 WT）、而不是乙酰酶活关键位点突变型（NAT10 G641E），可以显著抵消敲除NAT10对NOTCH3 ac4C修饰水平及mRNA稳定性的抑制作用。更进一步，作者发现沉默KAT7可以显著降低NOTCH3 mRNA ac4C修饰丰度，沉默SIRT7则相反。此外，与癌旁组织相比，食管癌组织尤其是转移灶中NOTCH3 mRNA ac4C修饰水平显著上调。功能上，NAT10可以显著促进NOTCH3野生型（NOTCH3 WT），而不是ac4C修饰位点突变型（NOTCH3 Mut）细胞的侵袭。以上结果表明，NOTCH3 mRNA的乙酰化修饰介导了NAT10 K823-Khib促进食管癌的侵袭转移。

蛋白质翻译后修饰具有可逆性，因此，靶向其修饰过程重要分子及位点，可能成为有前景的治疗策略。作者结合分子对接和功能筛选得到特异性抑制NAT10 K823-Khib的先导化合物7586-3507。一系列体内体外实验显示，7586-3507有效抑制食管癌侵袭转移。机制上，7586-3507通过抑制KAT7与NAT10蛋白结合，抑制NAT10 K823位点的Khib修饰，进而增强NAT10的泛素化降解，抑制侵袭转移。

总的来说，本研究发现了Khib修饰新的修饰酶和去修饰酶，拓展了新型酰化修饰的研究领域，将其与RNA修饰相关功能联系起来，揭示蛋白质Khib修饰及RNA乙酰化修饰如何促进肿瘤转移。先导化合物7586-3507直接阻断NAT10 K823的Khib修饰，进而抑制NOTCH3 mRNA ac4C修饰发挥抗癌活性。这些发现不仅突出了NAT10 K823-Khib作为食管癌转移生物标志物和治疗靶点的可行性，而且提示靶向新型酰化修饰具有很好的应用前景。

广州医科大学附属第五医院李斌教授是本文的唯一通讯作者，研究生廖龙、何妍、李树俊、余小梅和上海胸科医院刘智超医生是该论文的共同第一作者。广州医科大学的刘金保教授和上海胸科医院李志刚教授也为该研究做出了重要贡献。

李斌教授团队聚焦翻译后修饰表观遗传，进行肿瘤靶点筛选鉴定及靶向干预探索。近期在Cell Research、Cancer Research、Nature Communications、Advanced Science、Signal Transduction and Targeted Therapy、Clinical Cancer Research、Oncogene、Acta Pharmaceutica Sinica B、Cancer Communications 等杂志发表多篇相关研究。近5年主持国家自然科学基金、国家重点研发计划子课题及省市课题等。课题组拟招收医学、生物学及生物信息学方向的副研究员、助理研究员、博士后和科研助理若干。原文请见：广州医科大学“南山学者”杰出人才李斌团队研究助手及博士后招聘

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原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41422-023-00793-4

专家点评

赵英明（The University of Chicago）

蛋白质新型酰化翻译后修饰是目前生命科学领域的前沿和研究热点之一。鉴定癌症等重大疾病新型酰化修饰的位点，对于阐明疾病的调控机理和发现新型标志物有着重要的指导意义。2-羟基异丁酰化修饰（Khib）是2014年在组蛋白上发现的一种较高丰度、且在原核生物和真核生物广泛存在的新型赖氨酸修饰。早期对Khib修饰的研究主要集中在组蛋白上，其可以动态调节染色质的功能和基因表达，参与生物学过程，但非组蛋白上Khib修饰的功能机制尚不明确。李斌团队的最新研究首次绘制了肿瘤转移中2-羟基异丁酰化修饰的修饰图谱，揭示了Khib对RNA代谢过程具有重要的作用，并鉴定到肿瘤转移中关键的Khib底物蛋白NAT10。更为重要的是，NAT10在癌症中上调表达的机制尚不清楚。该研究通过筛选实验发现KAT7是肿瘤中新的Khib修饰酶，一系列分子生物学实验证实了KAT7对NAT10 K823-Khib调控的特异性，并发现NAT10 K823-Khib招募去泛素化酶USP39进而增强其稳定性，从而导致NAT10的上调表达。在此基础上，SIRT7也被证实具有去Khib修饰的作用。这一新发现不仅拓展了Khib修饰研究的维度，更重要的是，揭示了Khib呈现特殊分布特征的内在调控机制, 为加快解析新型酰化修饰与肿瘤发生发展的关联, 并提出干预策略指明了新的方向。

专家点评

李海涛（清华大学）

蛋白质翻译后修饰是后基因组时代研究的新型学科和热点领域，新型酰化修饰增加了从基因组到蛋白质组学的复杂性，从而调控机体多样化的生命活动。解析新型酰化修饰将为蛋白质的功能研究提供全面的数据，参与修饰调控的关键分子将成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点。李斌团队结合2-羟基异丁酰化修饰组学数据及实验验证，首次鉴定出第823位氨基酸是N-乙酰转移酶10（NAT10）的重要Khib修饰位点，且预示着不良预后。在肿瘤转移过程中，NAT10 K823-Khib修饰水平明显上升，提示NAT10 K823-Khib具有重要的生物学功能。为了验证NAT10 K823-Khib状态的作用，作者构建了模拟非Khib修饰状态的NAT10突变（NAT10 K823R）。体内体外的敲除和回复实验显示，突变NAT10 K823-Khib修饰位点不能抵消敲除NAT10后对肿瘤侵袭和转移的抑制作用，说明khib修饰介导了NAT10的功能。这是一项非常全面且影响深远的研究，对癌症生物学和RNA生物学界具有重要意义。此外，该项研究还发现抑制NAT10 K823-Khib修饰的先导化合物，并初步证明该化合物对肿瘤的抑制作用，为抗肿瘤药物的开发提供了新思路。李斌教授专注于翻译后修饰和肿瘤转移的基础与转化研究，近期率先揭示Khib修饰异常促进肿瘤的分子机制取得一系列突出成果。我期待他的进一步工作帮助我们更深刻地了解翻译后修饰调控生命过程的机理。

专家点评

伊成器（北京大学）

目前对NAT10在人类疾病中发挥作用的机制仍存在争议。有研究认为NAT10作为蛋白乙酰转移酶调控生物学功能，另有研究则认为NAT10主要通过介导RNA乙酰化（ac4C）发挥作用。ac4C是众多RNA修饰中一种高度保守的表观转录后修饰，但是，目前对ac4C修饰在mRNA分子上是否存在仍有争议。因此，探究ac4C修饰特异的调控机制对ac4C研究领域具有重要意义。广州医科大学李斌团队发表在Cell Research 上的最新研究成果揭示了ac4C修饰在肿瘤转移过程中的动态变化。机制上，作者通过对acRIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析，发现NOTCH3 mRNA是一个受NAT10修饰酶介导的ac4C修饰调控的关键分子，并且NAT10通过增加NOTCH3 编码区的ac4C修饰来增强其RNA的稳定性。作者使用单碱基的化学测序方法成功对NOTCH3 mRNA上的ac4C修饰位点进行了验证和定量分析。该研究结合多种实验技术，在单碱基水平证明NOTCH3 mRNA分子上存在ac4C修饰，并揭示肿瘤转移过程中NAT10(khib)-NOTCH3(ac4C)-fibronectin这样一个全新的信号级联反应。该研究为mRNA ac4C修饰的存在以及调控功能提供了直接的证据。同时，我相信此项工作将会为后续的mRNA ac4C修饰相关机制研究提供重要的研究思路。

制版人：十一

参考文献

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