长时程自动监测细胞状态，让类器官培养更容易

2023-02-17 23:34:52, 陈老湿德国赛多利斯集团

类器官正在迅速成为基础研究和药物发现的有力工具，这些与自身器官结构类似的三维（3D）组织可在体外生长，形成其原生器官的“微缩版本”。作为自我组织和自我更新的三维结构，类器官比传统的单层培养技术具有明显的优势，并提供了一个更符合生理学的环境，可更清晰地了解复杂的生物学。

类器官培养的起始点可以是存在于组织中的特异性成人干细胞、从患者活检样本中提取的肿瘤干细胞、胚胎干细胞（ESCs）或多能干细胞（iPSCs）。在三维细胞外基质中进行培养，这些培养物能够高度保真地重现出已分化组织的体内架构、空间形态以及原始组织中细胞群的遗传多样性^[1]。

由Incucyte® 实时活细胞分析系统和配套类器官分析软件实现的定量化、免标记的体外分析方法，逐渐成为类器官在基础研究、疾病建模和药物筛选中的必要条件。

类器官培养条件优化

Incucyte® 类器官实验流程

Incucyte® 实时活细胞分析系统可完成数小时、数天或数周的细胞健康状态监测，可从4个参数进行类器官培养状态分析：

类器官大小和数量

确定最大类器官扩增的最优条件。将小鼠肝脏类器官嵌入Matrigel® Dome（100%），在48 孔板中以多种密度接种。接种后五天获取BF 图像。每隔6 小时收集数据，总计168 小时。4 倍镜拍摄所有图像。每个数据点代表均值±SEM，n=14 个孔。

偏心度和暗度

使用综合形态定义特定细胞类型的传代频率。将小鼠肝脏类器官嵌入24 孔板中的100% Matrigel® Dome（1:10 传代）。每隔6 小时收集数据，总计192 小时。4 倍镜拍摄所有图像。每个数据点代表均值± SEM，n=6 个孔。

该功能可用于优化类器官培养条件，鉴定类器官最佳成熟阶段，实时监测类器官分化及生长效率，提供高通量、实时、自动的类器官分析方案。

类器官药敏分析

日本福岛县立医科大学的研究人员^[2]使用Incucyte® 与Caspase-3/7 绿色荧光染料相结合观察经典抗肿瘤药物紫杉醇、卡铂、丝裂霉素C对患者来源肿瘤类器官（F-PDOs）的细胞生长抑制作用。

10 μM药物孵育6天中的F-PDOs使用Caspase-3/7 绿色荧光染料监测结果显示丝裂霉素C样本组中有明显的凋亡蛋白酶激活现象；而在紫杉醇样本组中虽然能看到抑制F-PDOs球体生长的效果，但凋亡蛋白酶激活信号不显著。

有趣的是，紫杉醇的细胞生长抑制作用在长时间观察后发现并不完全依赖于Caspase凋亡通路。此外，这些结果也与患者临床上的耐药性一致，显示类器官培养体系可作为进一步的临床用药指导。

值得注意的是，在3D活细胞成像方面我们需注意过度曝光可能导致细胞损伤，从而导致生物学行为的改变，对实验分析和解释产生负面影响。光毒性效应是累积的，与激发光强度和总光子负荷成正比。因此，非侵入性实时3D成像的成功应用，关键在于平衡，以最大限度地提高光收集效率，同时最小化总样本量的激发能量。因此，Incucyte® 实时活细胞分析系统，采用专利的图像采集技术，结合Incucyte® 类器官分析软件可实现对类器官形成和生长过程动态、定性、准确的评价。

这一突破性的成像与分析技术对于类器官技术应用与发展具有重要的优势：

自动定位分析嵌入 Matrigel® Dome 中的 3D 类器官
使用集成、实时免标记的数据
采集优化和定义培养条件和方案根据综合的形态参数，确定用于类器官培养物的传代或扩增的最佳时间
评估多次传代期间的培养质量

毫无疑问，人类类器官系统将继续进步，以更好地理解复杂的疾病机制。客观准确地定义诸如接种密度、传代频率和形态等参数，对于建立用于下游研究的健康培养物和释放类器官的全部潜力至关重要。Incucyte® 帮助科学家从类器官大小、数量、偏心率（圆度）和暗度（亮度）四个参数，无偏倚地评估类器官生长状态，从而消除人的主观性解读。

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《3D细胞模型 | 类器官分析指南》

-参考文献-

Dutta D, Heo I, Clevers H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends Mol Med. 2017 May;23(5):393-410. doi: 10.1016/j.molmed.2017.02.007.
Tamura H, Higa A, Hoshi H, Hiyama G, Takahashi N, Ryufuku M, Morisawa G, Yanagisawa Y, Ito E, Imai JI, Dobashi Y, Katahira K, Soeda S, Watanabe T, Fujimori K, Watanabe S, Takagi M. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncol Rep. 2018 Aug;40(2):635-646. doi: 10.3892/or.2018.6501.

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