全自动MAM工作流程助力生物治疗药物各阶段关键质量属性分析

2023-02-17 09:05:39, 帝肯生命科学帝肯（上海）实验器材有限公司

生物制药领域如单克隆抗体（mAb），双特异性抗体，抗体偶联药物（ADCs），寡核苷酸，多肽等，质谱技术已经广泛应用于药物发现，药物开发，药代动力学研究和临床药物试验，药品QA/QC的全过程，用于高效表征生物分子的结构和功能。

生物制药的开发和生产过程非常复杂，即使微量杂质如糖基化及电荷异质性等属性的变化，也会对最终产品的安全性和功效产生重要的影响。传统方法通常需要多种分析技术来评估生物制药产品的所有属性，但其必然带来更多时间和资源的支出。MAM（多属性方法学）是一种基于肽图分离与高分辨质谱联用的正交方法，旨在实现单个LC-MS实验来取代多个传统的QC放行和稳定性测试方法。近年来，MAM已被生物治疗行业和监管领导者广泛接受。大型生物制药公司正在进行大量投资，以建立MAM工作流程，以证明其生物治疗药物的开发和生产。

通常，生物治疗药物生产过程中所得样品性质各异，对后续的分析来讲存在较高的挑战。本文将介绍一种全自动的MAM工作流程，可以成功去除干扰物如盐、表面活性剂、赋形剂、染料等，可以应用于从生物反应器到最终产品的各个阶段。

实验方法

样品制备及试剂

将48份100ug NISTmAb RM 8671样品分别溶解于5%SDS，50mM TCEP pH 7.55至终浓度为2ug/uL。其中12份样品分别加入8ug SILu^TM MAB重标的抗体。洗脱之后，将样品进行氮吹，之后加入200ul流动相A溶液（含24fmol/ul Pierce ^TM肽段）进行重悬。

基于S-Trap^TM试剂盒的全自动MAM工作流程—

Tecan Freedom EVO及Resolvex A200

液体处理工作站Freedom EVO 150整合

Resolvex A200

LC-MS/MS方法

色谱柱: Avantor ACE 3 C18-300 2.1x50mm
流动相A：0.1%甲酸水
流动相B：0.1%甲酸乙腈
柱温：+40°C
进样体积：2μl
液相流速：500 μl/ml
质谱：SCIEX ZenoTOF 7600
离子源：Turbo IonSpray
扫描方式：Positive TOFMS
IonSpray Voltage: 5500 V
Turbo Heater Temperature: +500 °C
MS1 acquisition mass range (m/z): 300-1500
Accumulation time (s): 0.25
去簇电压(V): 80
碰撞电压(V): 10

结果分析

所得LC-MS谱图如下所示，所有谱图的保留时间偏移在可接受范围内，相邻空白的谱图无肽段检出，表明无交叉污染，综合表明此蛋白酶解、脱盐的实验流程可靠。

为验证此方法的重复性，分别选择NISTmAb RM 8671，SILuMAB^TM和Pierce^TM肽的代表性肽段及其双电荷离子，计算其峰面积及CVs。结果表明，所有肽段的CV值≤20%，这其中还包括由LC-MS引入的分析误差，结果具有高度重复性。

通过其他质谱仪如Agilent 6546，获得了一些数据如下图，显示此方法的肽段覆盖率在99%-100%，以及一些预期的糖基化、二硫键、氧化和脱酰胺等。此外，通过Bruker TimsTOF分析鉴定出超过100种宿主细胞蛋白（HCPs），这些HCPs来源于生产mAb RM8671的鼠细胞系。

此方法的去污能力强。采用S-Trap处理后，从下图可见该方法可明显去除去污剂，PEG等其他干扰物。

总结

该自动化MAM工作流程，具有可重复性，且通量高，单次可处理96个样品；一次样品前处理，即可轻松监测多个质量属性；可以有效的节约样品前处理时间；全流程自动化，可减少人为引入误差，亦方便方法转移。

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