核酸脂质纳米粒科普——RNA-LNP包封率测定

2023-02-17 07:54:53, 锘海生命科学锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司

自新冠mRNA疫苗成功上市以来，脂质纳米粒（Lipid nanoparticle，LNP）已成为mRNA、siRNA、pDNA等核酸的优先递送载体，广泛用于mRNA疫苗及治疗。微流控技术是目前制备核酸脂质纳米粒最先进也是最常用的技术，包封率则是评价其制备效果的重要指标之一，下面就为大家介绍使用RiboGreen测定RNA-LNP包封率的方法。

RiboGreen检测RNA-LNP包封率的原理

1.1 RNA-LNP包封率（Encapsulation efficiency，EE）

包裹在脂质纳米粒内部的RNA占RNA-LNP溶液中全部RNA的比例。

1.2 RiboGreen检测RNA原理

RiboGreen是一种用于定量检测溶液中RNA含量的超敏感荧光核酸染料，当RiboGreen荧光染料处于溶液状态时，几乎没有荧光活性，与RNA结合时，其荧光活性将增加1000倍。RiboGreen-RNA复合物的荧光激发波长约500nm，发射波长约525nm，通过酶标仪，建立已知浓度RNA的标准曲线，即可得到样品RNA浓度。

1.3 RiboGreen检测包封率原理

分别测定LNP-RNA溶液中游离RNA浓度，以及用Triton-100破坏LNP结构后，溶液中全部的RNA浓度，两者的差值就是包封在LNP内部的RNA浓度。通过以下公式即可计算得到包封率结果。

图1核酸脂质纳米颗粒的示意图

操作要点

2.1制备Buffer

1X TE Buffer：使用试剂盒中20X TE Buffer稀释。

2% Triton-TE buffer：使用Triton-100与1X TE buffer以体积比1：50配制。

2.2添加RNA-LNP样品至全黑96孔板

根据制备时RNA的量，可以大致计算需要稀释的倍数。例如，已知 mRNA的原始质量或浓度，使用铭汰MicroFlow S进行RNA-LNP合成，根据稀释、超滤等处理后的最终体积，即可估算大致总RNA浓度。同时，假设90%的包封率，即可估算游离RNA浓度。然后根据标曲的最高浓度计算需要稀释的大致倍数。

这样我们就可以使用1X TE buffer将RNA-LNP稀释适合倍数以检测LNP外游离RNA浓度，使用2% Triton-TE buffer将RNA-LNP稀释适合倍数以检测总RNA浓度，建议每项检测至少两个不同稀释倍数。

最后，分别移取100 μL稀释后的样本，添加到全黑96孔板。

2.3标样添加

一般直接使用试剂盒中100 μg/mL的RNA标样，也可以使用与待测样本类似的RNA标样来建立标准曲线。可以先用1X TE buffer将原始标样稀释到工作浓度4 μg/mL，然后参考表1的体积比，配制为一定浓度梯度的标样。分别移取各浓度的标样100 μL，添加到全黑96孔板中。

表1 标样中各成分占比

TE buffer体积占比(%)	Triton-TE buffer体积占比(%)	4 μg/mL RNA储备液体积占比(%)	最终RNA浓度（ng/mL）*
0	50	50	1000
25	50	25	500
45	50	5	100
49	50	1	20
50	50	0	0

注：*最终RNA浓度考虑了步骤2.4添加RiboGreen染料后的浓度

当RNA-LNP样品及特定浓度的标样添加到96孔板后，需要在37℃下避光孵育10 min，以使RNA-LNP在Triton buffer中充分裂解。

2.4 RiboGreen染料添加

把试剂盒中RiboGreen试剂，使用1X TE Buffer按照1：100的比例稀释，例如需要2000 μL RiboGreen染料，可将20 μL的RiboGreen试剂添加到1980 μL的1X TE Buffer中。然后各取100 μL加入到已经加有样品的96孔板中，37℃下避光孵育5min。