mRNA疫苗上市关键：安全性和有效性评价方法的建立

2023-02-09 17:46:46, 江江赛默飞世尔科技生命科学产品

我们对于“疫苗”二字的感受，或许从来没有像今年这样鲜明。一场新冠疫情，让疫苗成为了全民关注的焦点。目前，全球新冠疫情仍在持续，国内疫情防控已经进入常态化，而疫苗则是最终取得这场生物战疫胜利的关键一步。

根据世界卫生组织（WHO）2020年11月12日发布的统计结果，全球已经有48款新冠候选疫苗进入临床试验阶段，其中11个进入临床III期。值得注意的是，目前全球还未有获得最终批准上市的新冠疫苗，我国目前开放的疫苗也均为针对重点人群的紧急使用。

在众多疫苗中，mRNA疫苗无疑是这场疫苗研发大战中关注度最高的，其进度也是众多创新疫苗策略中最快的。这种疫苗将外源目的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞并表达目的蛋白、刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。得益于其在安全性、有效性和生产速度上的独特优势，目前这种基于mRNA技术的疫苗策略已经步入上市申请阶段。

疫苗上市的关键一步：安全和有效性评价

新冠疫苗临床评价的喜与忧

日前，新冠mRNA疫苗研发领导者，Moderna和辉瑞/BioNTech先后宣布，其新冠候选mRNA疫苗在各自的III期临床研究中分别获得高达94.1％和95%的有效率且未出现严重的安全性问题，使得这两款mRNA疫苗的上市进度更加备受关注。

而更早的时候，这两款mRNA疫苗也都报道过一些接种志愿者出现了相关毒副作用，未影响临床研究的进程，但也使得人们对疫苗的态度尤为谨慎。但是，阿斯利康/牛津大学和强生研发的腺病毒载体类新冠疫苗此前由于出现严重的副作用分别被叫停了临床试验更是给疫苗研发敲醒了警钟，目前这两款疫苗都已经重启了临床试验。

任何产品，在各项指标评估过关后方能进入使用是一个必然的过程，对于像疫苗这样攸关性命的医疗制剂更是如此。而事实上，疫苗从研发到上市其实是一个严谨而漫长的过程，而新冠疫苗的研发周期已经由常规疫苗研发的10-15年被压缩到1-2年；但对于像新冠病毒这样突发的新型病毒，人类目前对其产生的保护性免疫反应的特点还尚不十分明确，因此，疫苗的有效性和安全性评价也更加需要重视，这从国内外制定的一系列政策中也不难看出。

政策伴行：

4月9日，WHO发布了新冠病毒疫苗的目标产品简介，列出了其对新冠病毒疫苗产品的多项指标希望达到和最低限度应该达到的标准。其中指出疫苗有效率的最低标准是50%；安全性方面，希望在观察到疫苗有效性的前提下具有高度有利的效益/风险比，只有轻度、暂时的副作用、无严重副作用。7月1日，美国FDA发布的面向生物医药行业并立即生效的新冠预防疫苗开发和批准指南中也强调，在含安慰剂对照的临床试验中，候选疫苗在主要疗效终点至少达到50%。

今年8月，为指导我国新冠疫苗的临床研发，提供可参考的技术标准，在国家药品监督管理局的部署下，药审中心组织制定了《新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则（试行）》等5个指导原则。

其中《新型冠状病毒预防用疫苗临床评价指导原则（试行）》指出新冠疫苗的保护效力应通过Ⅲ期临床保护效力试验进行评价。同时，还应对疫苗产品自身的安全性风险和接种带来的风险进行评估。如果疫苗有足够的保护效力，且具有可以接受的安全性，则具备获准上市的条件。疫苗上市后，应继续观察在大范围接种情况下的安全性和临床保护效果，并对保护持久性继续进行研究。

11月24日，为进一步规范和指导疫苗临床试验抗体分析的研究，药审中心发布了《疫苗临床试验抗体分析方法研究技术指导原则》（征求意见稿），进一步指出，疫苗免疫原性评价是疫苗临床评价体系中的重要内容之一，而疫苗抗体又是疫苗免疫原性评价的重要指标。创新型疫苗研发时，现有的抗体分析方法可能无法适用，需要结合疫苗的特点重新建立新的抗体分析方法。

mRNA疫苗作为一种创新性疫苗，和其他疫苗一样，安全性和有效性是其研发是否成功的关键指标。8月发布的5个指导原则之一《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》中也指出，尽管mRNA疫苗在埃博拉病毒等多种传染病临床研究中取得了一定的研究进展，但尚存在待确证的诸多问题，如，mRNA本身具有的潜在免疫原性、递送系统（如，脂质纳米颗粒）的稳定性、纳米剂型安全性及所使用阳离子聚合物/脂质体安全性、递送靶向性及递送效力等诸多问题，影响疫苗的有效性、安全性和质量可控性。

对于mRNA疫苗，疫苗进入体内后的吸收分布，引起的免疫原性和毒性，以及疫苗的功能性等，均是检验疫苗安全性和有效性的重要方面，其中免疫原性和功能效力的分析具体可以对应到体液免疫和细胞免疫的这两种常见免疫机制的检测和分析。

免疫原性和效力分析——体液免疫

体液免疫是以浆细胞产生抗体来达到保护目的免疫机制，其最常见的评估方法是对中和抗体的检测。一下是几种常见的中和抗体检测方法以及其特点。

PRNT和FRNT：基于细胞水平的菌斑减少中和实验(PRNT)和病毒灶减少中和实验(FRNT)，这种传统的检测方法存在成本较高、耗费人力、受主观因素影响大、不能实时观测等限制因素。

高内涵（HCS）分析技术：HCS分析技术在mRNA疫苗中和抗体研发过程中，其自动化高通量筛选可以发挥如下优势，从而大大加速早期研发进程并可更好的进行机理研究。

● 实现早期病毒感染检测（感染后17小时内）

● 极大程度节省样本

● 与常规噬斑实验检测高度相关

● 减少主观分析因素影响（超多维度综合评估）

● 降低人工操作带来的安全风险（全自动化机械臂操作）

ELISA：目前几乎关于所有的疫苗免疫原性分析当中都离不开体液免疫产生的靶点特异性IgG检测。基于酶标仪的ELISA方法是一种非细胞水平的结合实验，也是一种极为熟悉且经典的检测技术。

▲ 赛默飞提供高灵敏、多功能的酶标仪检测平台Varioskan™ LUX，可进行包括光吸收、荧光、化学发光、时间分辨荧光、HTRF、 FRET、Alpha 等多种方式检测，并为此提供多种灵活的ELISA检测方案

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免疫原性和效力分析——细胞免疫

体液免疫和细胞免疫都属于特异性免疫，其区别在于体液免疫的来源是B淋巴细胞，而细胞免疫的来源则是T淋巴细胞。细胞免疫的作用机制主要是包括两个方面，致敏T细胞的直接杀伤作用，以及其释放细胞因子的协同杀伤作用。因此常用的mRNA疫苗细胞免疫分析指标也大致可分为T细胞相关表型指标和相关细胞因子分析这两类。

此类检测通常需要用到流式细胞术，对药物可能引起的免疫反应及细胞功能变化进行检测分析。主要包括如下几种应用：细胞免疫表型及胞内细胞因子检测、疫苗的免疫效力评估、疫苗接种后的免疫功能评价、监测疫苗接种后的安全性。

今年3月，在Thevarajan et al.在Nature medicine上发表的一项新冠病毒研究中，就使用了Invitrogen抗体通过流式细胞术监测了非重症型病人对SARS-CoV-2的免疫应答。

赛默飞可以提供流式细胞术完整解决方案，快速、灵活、高效的 Attune™ NxT 流式细胞仪和品类齐全的eBioscience 流式抗体试剂，是免疫效力评价的有力工具。

▲ 利用赛默飞Invitrogen ™ Attune ™ NxT 流式细胞仪进行腺病毒5型寨卡病毒疫苗免疫效力评价

对细胞因子的检测，除流式方法外，通常还会用到酶联免疫斑点检测（ELISPOT），来实现单细胞水平的因子检测。

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mRNA疫苗的安全性评价

疫苗的安全性在疫苗研制过程中无疑是至关重要的，尽管mRNA疫苗避免了一些与其他疫苗技术（比如病毒性疫苗平台）相关的一些常见风险，但仍然需要对其可能出现的一些安全性问题来进行分析，其中包括局部和全身性的炎症反应，表达的免疫原是否能够持续存在，与非本体的核苷酸以及传递系统成分相关的一些毒性，以及 mRNA体内生物分布的情况。

通常疫苗的安全性评估试验（例如QC试验或佐剂研制）是在动物模型中进行的，这种传统的在动物模型中的毒性试验具有一定的局限性，因为生物体本身的复杂性和多样性会影响其结果参数，从而导致结果不能准确的推断一些不良事件相关的因素。

对此，可以从生物标志物分析以及生物分布分析来展开对疫苗安全性的评价，目前，生物标志物基因表达图谱已经被用于合成药物开发和生物制剂的安全性评价。

如果与免疫毒性反应和免疫原性高度相关，生物标志物基因表达水平则很可能成为疫苗和佐剂安全性的优越预测因素，其具有即时的结果输出、适用于不同疫苗接种途径和剂量的安全性评估、可预测不同临床发展结果等显著优势。因此，主要基于分支DNA(bDNA)信号放大技术的定量基因分析（ QuantiGene assays ）技术为生物标志物基因表达定量提供了一种精确的方法。

▲赛默飞开发了实用的疫苗安全评估系统QGP，用于评估管理路线，提供可靠和全面的安全数据

QGP在疫苗安全性评价中具有非常重要的应用，其适用于多基因分析，具有每孔可检测多达80个基因的靶点检测水平，可以实现快速的样本制备，并且从样本到定量检测不需要进行RNA的纯化，捕获目标RNA时，QGP以 Luminex ® 磁珠作为介质，最后的检测也是在Luminex ® 多因子平台上进行。

为进一步实现在同一台仪器上同时检测mRNA和蛋白（细胞因子标志物），赛默飞的QGP 和蛋白质定量免疫测定ProcartaPlex ™在Luminex ®仪器上同时进行核酸和蛋白的检测。

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结语

目前，基于mRNA技术作为一种新的预防和治疗方法越来越受到人们的关注，无论是其在新冠病毒领域的开发，还是作为肿瘤疫苗在癌症领域的应用前景和潜力，都备受认可。Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技）作为全球科学服务领导者，可提供从靶点筛选与发现，mRNA的生产、纯化、高效递送到分析方法建立的mRNA研发完整解决方案，帮助应对研发路径上的各项关键技术挑战，提升mRNA疫苗的有效性与安全性。

相信随着政策越来越明晰，行业各领域持续赋能与创新，基于mRNA这一新型技术的疫苗策略将在各领域进一步发挥其强大潜能。

参考出处：WHO官网、FDA官网、CDE官网、赛默飞世尔科技官方网站