妙手回“纯”秘籍大放送（下）| 耗材促销三重惊喜等你来

可能原因：缓冲液或样品未进行过滤、蛋白沉淀或杂质残留、清洗不及时等引起层析柱滤膜堵塞；流速过快、流动相粘度 ( 如乙醇等 ) 过高、温度过低。

建议处理方法：首先将柱子卸下来，确定是系统还是柱子堵了。如果是柱子堵了：参考说明书CIP操作进行清洁；更换层析柱顶端滤膜或超声清洗 (HiPrep 与 Precision Columns 3.2/300 柱型不能拆卸换膜 ) ；必要时移除层析柱顶端 2-3mm 凝胶，调节 Adaptor 消除顶端死体积。部分预装柱，也可以将填料倒出，去除板结或碎填料后，重新装填。测定柱效或重复之前做过的样品。后续，注意样品前处理 ( 如核酸的去除、样品缓冲液条件 ) 以及层析柱的日常维护。

制备级凝胶过滤纯化：对于分辨率有较高的要求：(1) 上样体积一般在柱体积的 0.5% – 4% ；(2) 运行较低的流速；(3) 使用较高的柱子 ( 一般 ≥60 cm)。经过纯化后的样品将被直接置换到合适的缓冲液条件中，用于后续的实验或储存。

分析型凝胶过滤层析：对于分辨率有很高的要求，上样体积一般在柱体积的 0.3% – 0.5% ，使用柱子的高度一般为 30cm。而在快速纯度检测和筛选实验中，常用的是 15cm 柱高的柱子，可以在提供足够的分辨率的前提下，缩短运行时间，节省样品和缓冲液。

脱盐与缓冲液置换：与上述的精细分离不同，脱盐或缓冲液置换属于组分分离，即将大分子样品与小分子或离子进行分离的过程，因此对于分辨率的要求相对不高。上样体积可达柱体积的 30%。

根据目标蛋白的大小选择适合的分离范围。

根据上样量，选择合适的柱体积的柱子类型。上样体积一般在柱体积的 0.5%-4%。

根据具体需求确认柱子具体型号，一般选择高分辨率的柱子。

FF（高流速）、HP（高分辨率）系列：20 mM磷酸钠缓冲溶液，500 mM NaCl(避免非特异 电荷吸附)，20-50 mM 咪唑(提高浓度，可以增加纯度但会降低收率)，pH7.4 (可以根据实际情况调节pH)。

Talon 系列：20 mM 磷酸钠缓冲溶液，500 mM NaCl，10-20 mM 咪唑，pH7.4。

Excel 系列：20 mM 磷酸钠缓冲溶液，500 mM NaCl，pH7.4 (结合缓冲液中一般不添加咪唑，在wash缓冲液中可根据样品性质加入 0-30 mM 咪唑)。

洗脱缓冲溶液：20mM 磷酸钠缓冲溶液， 500 mM NaCl，500 mM 咪唑，pH 7.4。