“德尔塔”毒株来袭！科学界是如何做到快速分离检测到新冠病毒？

德尔塔变异株最早于2020年10月在印度发现，相较于野生型毒株，德尔塔变异毒株会更容易在人群中形成聚集性感染，并且降低现有疫苗、抗体等药物的有效性，形成免疫逃逸，从而蔓延至世界各地引发新一轮疫情。美媒日前披露该国疾病控制与预防中心(CDC)的报告指出，德尔塔新冠变种病毒的传染性和水痘一样高，对于突破新冠疫苗保护的能力更强，因此已接种疫苗的人仍可能感染，并传染给其他人。

随着南京新一轮疫情的爆发，研究发现，此次引发南京疫情的毒株正是目前广泛流行的”德尔塔“变异毒株。为了能够快速分离检测到变异病毒，南京政府也开始在各高校征集可靠的仪器进行检测。那么，对于来势汹汹的“德尔塔”变异株，科学界是如何快速分离并检测出病毒的呢？

在新型冠状病毒爆发初期，科学界普遍缺乏对新冠病毒的认识。COVID-19在全球的大流行，促进了利用PCR技术和测序技术检测SARS-CoV-2的应用。但是，SARS-CoV-2 研究越来越需要了解病毒如何发挥作用、如何影响身体和免疫系统、病毒如何随时间进化，以及如何开发新的疫苗和治疗方法。因此，分离病毒毒株可为研究该病毒的生物学性状、致病机理、流行规律等提供有力的病原学数据。

当前病毒毒株的主要获取手段为，首先将患者的肺泡灌洗液或者咽拭子标本经稀释、离心后取上清液、并接种在VeroE6细胞上。然后通过吸附培养、添加营养液、孵育离心后得到病毒分离液。分离到的病毒株又可进一步通过测序等试验分析该病毒是否发生变异，为后续抗击疫情工作提供重要信息。

在COVID-19疫情爆发的早期，许多机构均在第一时间分离纯化得到早期新冠病毒毒株。例如：疫情爆发初期，武汉病毒研究所将患者的支气管肺泡灌洗液样本接种于VeroE6和Huh7细胞中，成功分离出了SARS-CoV-2病毒。

福建省疾控中心将早期COVID-19病例的咽拭子样本接种于VeroE6细胞，放在36℃培养箱培养，成功从福建省早期COVID-19病例中分离得到SARS-CoV-2病毒。

广州海关技术中心取患者的咽拭子样本接种于Vero E6，培养3天后细胞也出现明显病变。通过qRT-PCR、全基因组测序和间接免疫荧光等方法验证，继而分离到第1株广州本地感染病例的SARS-CoV-2毒株。

以上事例说明，在疫情早期时候，除了严格防控疫情扩散外，分离纯化出完整的病毒毒株也是各项工作中的重中之重。

核酸检测方法包括RT-PCR、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、环介导等温扩增技术(LAMP）等。其中，实时定量PCR（qRT-PCR）作为SARS-CoV-2鉴定的金标准，也是世界卫生组织（ＷＨＯ）推荐的常规确认试验。

在进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）时，研究人员通过将SARS-CoV-2与冠状病毒相关序列比对，确定特异性的SARS-CoV-2引物，然后用qRT-PCR技术来验证其引物的灵敏度。该流程可成功检测出SARS-CoV-2病毒，并可成功区分SARS-CoV-2和其他冠状病毒如SARS-CoV等。

RenJ等^[1]建立了针对SARS-CoV-2基因组中ORF1ab和核衣壳（N）基因的qRT-PCR检测方法。应用此方法，研究团队在流行病学调查中发现一名无症状女童。2020年2月24日入院时，她没有临床表现。咽拭子的qRT-PCR呈阴性，但尿液呈阳性。而在接受了抗病毒和对症支持治疗后，2月26日，咽拭子qRT-PCR呈现阳性。表明，无症状患者的尿液具有传染性。当咽拭子的qRT-PCR阴性时，尿液中的qRT-PCR可能是一个有用的筛查补充。

值得注意的是，在SARS-CoV-2病毒序列还未公开发布之前，就有团队运用qRT-PCR技术，设计了一套SARS-CoV-2的诊断流程，并投入了实际应用。另外，为了增加灵敏度和特异性，该技术还有不少改进版本，比如Taqman探针法、双重或多重荧光PCR等。

环介导等温扩增 (loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术。能在等温（60-65℃）条件下，短时间（通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一种“简便、快速、精确、低价”的基因扩增方法。

其原理主要是基于靶基因3''和5''端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。

Shirato K等^[2]开发了一种新的RT-LAMP检测MERS冠状病毒的方法，使用针对保守核衣壳蛋白区域的引物序列，发现RT-LAMP法检测到的MERS-CoV RNA仅为3.4拷贝，特异性高，与其他呼吸道病毒无交叉反应。还进行了从含预滴定病毒的咽拭子接种培养基中检测MERS冠状病毒的初步实验，结果发现RT-LAMP检测灵敏度与MERS-CoV实时RT-PCR相似。对LAMP技术测定程序进行改进后，LAMP技术可以检测更微量的病毒RNA。

He, YG等^[3]建立了一种单管比色RT-LAMP方法用于视觉检测SARS-CoV-2 RNA。该分析将基于Si-OH磁珠(MBs)的快速RNA提取和快速等温扩增集成在一个单管中，从而绕过RNA洗脱步骤，直接扩增磁珠吸附的RNA分子，得到可视化的结果。这种单管比色RT-LAMP检测方法可作为一种快速、灵敏的COVID-19诊断检测的替代平台，特别适合在社区诊所或乡镇医院使用。

实现上述这些高灵敏的检测方法，一款高效强劲的试剂则是必不可少的。通常用于 LAMP 的酶是 Bsm DNA 聚合酶，其为 Bacillus smithii DNA 聚合酶的一部分，相当于 Bst DNA 聚合酶大片段。  它具有很强的链置换活性，最适温度为 60°C。Bsm DNA 聚合酶的扩增非常有效，可在短短15 分钟内复制 10 亿倍的 DNA 靶标。该酶对复杂样品中的抑制剂有很强的抵抗能力，所以植物组织、血液、尿液或唾液只需简单处理即可进行检测。

SHERLOCK技术由张锋团队于2017年发明，此后在拉沙热、埃博拉、寨卡病毒、登革热等RNA病毒疫情检测中大显身手。2020年2月14日，美国麻省理工学院Broad研究所张锋教授等人开发了一种基于SHERLOCK的COVID-19诊断技术。该技术具有特异的高灵敏度，每微升里仅10-100个病毒拷贝，就可以被检测出来。且步骤简单，只需三步，一小时内就可以完成检测。

此外，复旦大学的研究团队也开发出了一套名为“opvCRISPR”的新型冠状病毒检测系统，相较于主流的RT-PCR方法，该系统具有检测时间短、灵敏度高、结果可视化的特点。研究将逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）及Cas12a剪切酶整合到一个系统中，使该系统能够在45分钟内就能检测接近单个分子的样本，最终诊断结果也与实时定量RT-PCR测定结果一致。

测序技术具有高通量、短时间、高精确度等优点，可以快速精准定位目标基因。广泛用于病原体鉴定和监测病毒进化，在疫情初期此技术是最先检出SARS-CoV-2并成为确诊疑似病例的方法之一。

RenL等^[4]收集了武汉市金银潭医院5例重症肺炎患者的临床资料和支气管肺泡灌洗(BAL)标本。基于llumina测序平台，提取BAL的核酸并进行下一代测序。测序结果表明该病毒在系统进化上与蝙蝠SARS样冠状病毒(SL-ZC45, GenBank MG772933)最接近，核苷酸同源性为87.6%至87.7%，但属于一个单独的分支。此外，该病毒的受体结合区（RBD）的氨基酸序列与SARS冠状病毒相似，表明它们可能有相同的受体。

ChenL等^[5]用下一代测序技术（metagenomics Next Generation Sequencing，mNGS）对两名COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液标本进行宏基因组学分析，确定此病毒是一个新的冠状病毒种，病毒基因组的全长29881nt，并且归类为β属的一个新种。

随着科学界更深入地了解SARS-CoV-2病毒，赛默飞提供了创新、先进的解决方案，包括从病毒的分离，到多种检测方法建立，为未来做好积极准备，实现快速应对。

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