应用案例 – Rotea系统在PBMC分离、T细胞洗涤和浓缩、洗脱残留物中的应用

通过CTS Rotea系统使用红细胞裂解缓冲液，从新鲜白细胞单采样本（Leukopak袋）中分离PBMC，细胞计数仪评估其红细胞去除效率、回收率、活性和表型，并与使用密度梯度培养基手动分离的PBMC进行比较。使用Invitrogen单克隆抗体进行流式细胞分析，以评估各细胞类型的相对百分比。

用Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28（货号40203D）对PBMC中的T细胞进行激活和扩增，再使用流式细胞术进行分析，以评价T细胞亚型。扩增过程持续10天，分别在0、5、7和10天时对细胞数量进行计数。

在CTS Rotea系统上进行处理之前和之后，分析T细胞的回收率和活性。使用三台Countess II细胞计数仪读数的平均值确定活性和回收率。此外通过流式细胞分析以确保CTS Rotea系统的处理不会改变组成的免疫细胞类型的相对百分比。

在三次独立运行中，通过CTS Rotea系统使用红细胞裂解缓冲液从Leukopak袋中分离出的PBMC的活性和回收率始终较高（图2A），且处理后样本中的红细胞显著减少，T细胞显著增加 (图2B)。

图2：使用CTS Rotea系统进行PBMC分离。（A）PBMC的活性和回收率以及（B）未经处理的Leukopak袋中以及PBMC分离后细胞类型的相对比例。

使用CTS Rotea系统和使用Ficoll方法分离的T细胞之间的扩增率几乎相同，表明2种方法处理的细胞没有明显区别（图3A）。在扩增的T细胞中，辅助性（CD4+）、细胞毒性（CD8+）、CD62L+CCR7+以及耗竭（PD1+、LAG-3+）T细胞的百分比相似，这些T细胞在细胞治疗中都至关重要（图3B）。

图3.（A）使用CTS Rotea系统和密度梯度培养基分离的T细胞扩增。（B）使用CTS Rotea系统和密度梯度培养基分离的经扩增T细胞的特性鉴定。

将1升包含5×10⁸个细胞的培养基用作起始量，然后将输出体积从5 mL更改为10 mL，最后更改为20 mL。在CTS Rotea系统上进行处理后，所有输出体积（包括5 mL）的活性和回收率均>90% （图4）。在使用CTS Rotea系统进行T细胞洗涤和浓缩前后对细胞进行流式分析。两个样品组之间的CD4和CD8 T细胞群一致，表明使用CTS Rotea系统进行处理不会影响细胞亚群的相对比例。

图4：（A）5 mL、10 mL和20 mL输出体积下的T细胞洗涤和浓缩回收率和活性。（B）在执行CTS Rotea系统洗涤和浓缩方案前后，在CD4和CD8染色后进行流式细胞分析。

1. 首先使用CTS Rotea系统和Gibco™ CTS™ Rotea™一次性管路套件，从leukopak中储存的PBMC中分离出人T 细胞。

2. 解冻后，用Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28磁珠在以下T细胞完全培养基中分离和扩增T细胞：添加了Gibco™ CTS™免疫细胞血清替代物（SR）、Gibco™ L-谷氨酰胺、Gibco™ GlutaMAX™添加剂和白细胞介素2（IL-2）的Gibco™ CTS™ OpTmizer™ T细胞扩增无血清培养基（SFM）。

3. 扩增后，使用Gibco™ CTS™ DPBS或使用加入2%人血清白蛋白（HSA）的CTS DPBS作为洗涤缓冲液，在CTS Rotea系统上洗涤并浓缩T细胞。

4. 处理前后使用细胞计数仪分析T细胞回收率和活性。使用Nova BioProfile™ Flex2细胞培养分析仪测量残留葡萄糖浓度。使用Invitrogen™IL-2人类ELISA试剂盒和Invitrogen™人白蛋白ELISA试剂盒测定残留的IL-2和人血清白蛋白（HSA）浓度。通过气相色谱法（GC）测定输出物中残留DMSO的浓度（图5）。

5. 同时使用台式离心机手动洗涤T细胞。在50 mL锥形管中用10 mL或25 mL洗涤缓冲液洗涤T细胞，方法是以300 ×g重复离心T细胞5分钟，并将其重悬于洗涤缓冲液中。

通过CTS Rotea腔中的稳定流化床运行60 mL DPBS+2% HSA，可去除培养基中99%以上的残留葡萄糖。用120 mL相同洗涤缓冲液洗涤细胞后，未检测到葡萄糖（图6A）。使用70 mL DPBS+2% HSA洗涤细胞，可去除95%以上的残留IL-2，使用70 mL不含HSA的DPBS洗涤细胞，可去除95%以上的残留HSA和DMSO（图6B-D）。

图6.使用CTS Rotea系统的洗涤效率。从T细胞培养基中去除的（A）葡萄糖、（B）IL-2、（C）HSA或（D）DMSO的百分比。

CTS Rotea系统的最大处理容量为5×10⁹个细胞，本实验测试了2×10⁸、5×10⁸和5×10⁹个细胞的起始量。使用70 mL DPBS+2% HSA洗涤2×10⁸或5×10⁸个细胞，可去除99%残留葡萄糖，使用50 mL相同洗涤缓冲液洗涤5×10⁹个细胞，可去除> 99%残留葡萄糖（图7）。

图7：CTS Rotea系统对不同数量的T细胞的葡萄糖去除效率。

评价调整CF 比率对葡萄糖去除效率的影响。以25mL/min的恒定流速将向心力g 设定为1,200g,2,000g 或2,500g，以此来调整CF 比率。结果与先前测试的结果相似，使用70 mL DPBS+2% HSA洗涤细胞可持续去除>99%的残留葡萄糖（图8）。

图8.CF比率对CTS Rotea系统去除葡萄糖效率的影响。在（A）2,500 ×g、（B）2,000 ×g和（C）1,200 ×g下去除的葡萄糖百分比。

评估CTS Rotea系统洗涤或手动洗涤的残留IL-2去除效率，并比较了两种方法的处理时间。两种方法的IL-2去除效率相似；使用70 mL DPBS+2% HSA洗涤细胞，可去除95%以上的残留IL-2。使用10 mL洗涤缓冲液手动洗涤，可去除约85%的残留IL-2，但要去除90%以上的残留IL-2，需要使用50 mL洗涤缓冲液（图9）。使用145 mL洗涤缓冲液手动洗涤细胞耗时约135分钟，但使用CTS Rotea系统完成洗涤仅需45分钟左右。

图9.使用CTS Rotea系统和使用台式离心机手动洗涤的IL-2去除效率的比较。

在所有测试条件下均观察到，处理后的T细胞具有极佳的细胞活性和高回收率。细胞活性和回收率始终高于90%（图10）。

图10.洗涤和浓缩过程后的平均T细胞活性和回收率。