Cell Metab | Q-Flux：一种基于质谱的用于评估体内肝线粒体代谢通量绝对速率的方法

2022-12-28 15:18:21, Qi

撰文 | Qi

三羧酸（TCA）循环是所有生物体新陈代谢的中心枢纽，糖酵解、β-氧化、氧化磷酸化和糖异生（GNG）等反应在此处交叉，由于技术限制，人们对于肝脏TCA循环在生理或疾病中的动态配置知之甚少，比如哪些底物供应GNG，高胰岛素-正常血糖钳（HEC）期间，线粒体代谢通量仍然无法测量等。目前已有工作报道了基于[¹³C₃] 丙酸盐的通量方法、MIMOSA方法和位置同位素核磁共振示踪剂分析方法（PINTA）【1-3】，但都有各自的局限性，因此，需要开发一种能够规避位置特异性同位素异构体问题，同时还能监测线粒体氧化、回补和糖异生通量的方法。

2022年12月13日，来自耶鲁大学医学院的Gerald I. Shulman团队在Cell Metabolism杂志上发表了一篇题为Q-Flux: A method to assess rates of hepatic mitochondrial succinate dehydrogenase, methylmalonyl-CoA mutase, and glutaminase fluxes in vivo 的文章，他们开发了一种基于质谱的技术——Q-Flux，主要利用[¹³C₅]谷氨酰胺作为代谢示踪剂，用来评估体内关键肝线粒体通量的绝对速率，并在多种生理扰动情况下验证了该方法的有效性。

基于[¹³C₅]谷氨酰胺的方法Q-Flux（Q为谷氨酰胺单氨基酸缩写）是在同位素稳态下求解的一系列34个代数通量建模方程，建模广泛依赖于通过GC-MS和LC-MS/MS测量的前体和代谢产物的过量原子百分比（APE）的计算。为了确定谷氨酰胺是否是合适的代谢通量分析（MFA）示踪剂，作者将[¹³C₅]谷氨酰胺以不同速率注入小鼠体内，以6 mmol/(kg-min)的速率输注并不会扰乱全身谷氨酰胺或肝脏葡萄糖代谢。随后，作者继续向小鼠输注[¹³C₅]谷氨酰胺以评估TCA循环的可逆性，利用等式6（34个等式详见文章）发现复合体II（即琥珀酸脱氢—SDH）的反向速率是其正向速率的36%，证明了SDH的双向活性。

图1. TCA循环可逆性的评估证实了复合物II的双向活性。

尽管已知胰高血糖素会增加肝线粒体糖异生和氧化速率，以及肝脏谷氨酰胺酶（GLS）在高胰高血糖素血症期间介导糖异生增加的重要性【4】，但目前还没有研究组直接检测过GLS通量的绝对速率。为此，作者对小鼠进行胰高血糖素输注，两小时后，与对照相比，肝葡萄糖生成（HGP）和血浆葡萄糖浓度等显著增加，尤其注意SDH净通量的绝对率增加了68%，伴随V_SDH（F）和V_SDH（R）（分别代表SHD正向和反向的绝对速率）的升高。此外，作者还观察到甲基丙二酰辅酶A（V_MUT GNG）和谷氨酰胺（V_GLS GNG）的GNG速率分别增加了316%和117%。

迄今为止，体内示踪方法还没有被验证用于评估高胰岛素-正常血糖钳（HEC）条件下的肝线粒体回补通量，因而胰岛素刺激条件下生糖底物的利用和线粒体氧化速率是未知的。为此，作者将Q-Flux方法应用于在基础或HEC条件下上述指标的检测。除了与预期一致的胰岛素刺激降低HGP、总线粒体糖异生通量和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK) 通量速率外，丙酮酸羧化酶（PC）（>60%）和GLS被显著抑制（54%）。有趣的是，V_MUT/V_SDH（F）比率在HEC期间趋于增加，MUT 相对于PC（V_MUT/V_PC）的速率增加了650%，并且MUT相对于GLS（V_MUT/V_GLS）增加了425%。就线粒体氧化而言，胰岛素增加了V_SDH（R）/V_SDH（F），即将SDH的逆反应绝对速率增加> 60%，而正反应速率不变。此外，V_OGDH的绝对率降低了 40%（OGDH为αKG脱氢酶），V_OGDH/V_SDH（F）显着减弱。重要的是，异柠檬酸脱氢酶（IDH）通量的绝对速率没有变化，这表明下游脱氢酶的氧化速率降低是由谷氨酰胺回补减少而不是TCA循环的固有减慢驱动的。总之，这项工作开发的Q-Flux方法对于有兴趣探索体内线粒体回补和氧化通量调节的研究人员具有广泛的吸引力，有助于全面了解肝线粒体代谢。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2022.11.011

制版人：十一

参考文献

1. Hasenour, C.M., Wall, M.L., Ridley, D.E., Hughey, C.C., James, F.D., Wasserman, D.H., and Young, J.D. (2015). Mass spectrometry-based microassay of 2H and 13C plasma glucose labeling to quantify liver metabolic fluxes in vivo. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 309, E191–E203.

2. Alves, T.C., Pongratz, R.L., Zhao, X., Yarborough, O., Sereda, S., Shirihai, O., Cline, G.W., Mason, G., and Kibbey, R.G. (2015). Integrated, stepwise, mass-isotopomeric flux analysis of the TCA cycle. Cell Metab. 22, 936–947. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2015.08.021.

3. Perry, R.J., Peng, L., Cline, G.W., Butrico, G.M., Wang, Y., Zhang, X.M., Rothman, D.L., Petersen, K.F., and Shulman, G.I. (2017). Non-invasive assessment of hepatic mitochondrial metabolism by positional isotopomer NMR tracer analysis (PINTA). Nat. Commun. 8, 798. https://doi. org/10.1038/s41467-017-01143-w.

4. Miller, R.A., Shi, Y., Lu, W., Pirman, D.A., Jatkar, A., Blatnik, M., Wu, H., Ca´ rdenas, C., Wan, M., Foskett, J.K., et al. (2018). Targeting hepatic glutaminase activity to ameliorate hyperglycemia. Nat. Med. 24, 518–524.