scRNA+Bulk RNA肿瘤相关巨噬细胞高分思路

2022-12-28 11:51:43, 小明

今天给大家介绍一篇发在《J Immunother Cancer》IF:12+, 中科院一区杂志上的，关于“单细胞联合Bulk分析揭示肿瘤相关巨噬细胞在TME中的功能与机制”的文章，题目是“M1 hot tumor-associated macrophages boost tissue-resident memory T cells infiltration and survival in human lung cancer.”

肿瘤相关巨噬细胞个性化思路

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M1 hot肿瘤相关巨噬细胞促进驻留记忆T细胞亚群的浸润及肺癌患者生存

一

背景介绍

肿瘤相关巨噬细胞的作用在确定适应性免疫系统的抗肿瘤效果与肿瘤的抗免疫策略之间的结果目前依然是有争议的。巨噬细胞通过整合肿瘤微环境（TME）中的信号来调节其活动和表型。根据巨噬细胞被激活的方式，可以分为M1-like（抗肿瘤特性），或M2-like（促癌特性）。在许多实体肿瘤中，M2-like巨噬细胞的优势与较差的预后相关，但在某些肿瘤类型中，强的M1-like分布与较好的预后相关。本研究的目的是研究这些肿瘤相关巨噬细胞亚群的相互关系，以确定他们如何调节适应性免疫系统在早期肺癌中的有效性。

二

概述

在这篇文章中，作者基于手术切除的肺癌组织，利用单细胞转录组测序和bulk测序结合的方式刻画肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和癌旁组织的非肿瘤相关巨噬细胞（NTAMs）的特征。免疫组化将TAM转录组signature的分布与肿瘤中CD8+组织常驻记忆T细胞（TRM）的密度关联起来，并在393例肺癌患者的独立队列的生存数据中进行验证分析。作者发现TAMs和NTAMs的细胞具有显著不同的转录组谱，并且TAMs展示出了很强的M2-like signature，这在不同样本之间均是一致的。然而，由免疫染色细胞支持的单细胞RNA测序显示，在25%的M2-like TAMs样本中还共同表达了一种很强（或者热点）的M1-like特征（称为M1 hot）。作者通过分析发现，M1 hot的TAMs与TRM具有很强的相关性，这些都与患者更好的预后相关。此外，作者表明了一种机制：M1 hot的TAMs通过CXCL9的表达招募TRM细胞，并通过提供TRM所依赖的更多必需脂肪酸来维持它们。

三

正文结果

结果1：TAM同时富集到M2和M1特征

作者在33个配对的肺癌样本和癌旁组织的CD45+CD14+HLA-DR+ 细胞的全转录组分析（bulk数据），分别鉴定出肿瘤相关巨噬细胞，形成TAMs和NTAMs。通过差异表达分析，识别到1038个差异表达的转录本（图一AB）。通过t-SNE分析，发现这些差异转录本能够很好的将TAMs和NTAMs区分开（图一C）。基于Ingenuity Pathway Analysis (IPA)工具分别揭示了与M2样和M1样巨噬细胞基因图谱相关的促肿瘤和抗肿瘤功能的强烈激活（图一D）。此外，作者发现与M2原瘤功能相关的转录本，如血管生成（血管内皮生长因子信号传导）、金属蛋白酶活性、纤维化和癌症转移，在TAMs中表达水平高于NTAMs（图一E），这个结果在GSEA结果中得以证实（图二）。

图 1

图 2

此外，作者发现，与 NTAMs相比，IL-4、IL-10、IL-13和转化生长因子-β(TGF-β)等M2诱导细胞因子是TAMs的top上游调控因子，但令人惊讶的是，典型的M1诱导细胞因子如IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α也表现出类似的现象（图三）。这些数据表明肺癌中的TAMs同时表达了与M2基因图谱（肿瘤原体功能相关）和M1基因图谱（促进抗肿瘤T细胞反应有关）相关的更高水平的转录本。

图 3

结果2：M2类型TAM中均一而M1类型TAM异质性的特征分析

接下来，作者想知道根据bulk转录组测序数据，是否可以使用M1-like和M2-like signature基因（称为hot或cold）的相对富集对肿瘤样本中的TAMs进行分层，以确定不同的原瘤或抗肿瘤作用。作者从前人的研究中获取到122个已知的M2基因（包括CD209, IL10, WNT5A and MMP12等）和116个M1基因（包括CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, STAT1 and AIM2等）。分析发现，M2基因集在TAMs样本中表现出比较均一性（即比较统一），而M1基因集在TAMs样本中表现出异质性（图四ABC）。

图 4

在这个结果基础上，作者想知道，在含有这些M1 hot 的TAMs肿瘤中，是否与M2 TAMs存在互惠（reciprocal）关系，从而显示出较弱的M2信号。因此，作者挑选M1中异质性最强的代表基因之一CXCL9（图4B），并计算了CXCL9表达水平与M2基因(CD209, ADORA3, STAT6, SOCS3, IL10 and IRF4)的相关性，发现其实是不相关的（图4D）。并且在TAMs和NTAMs肿瘤的对比中，CXCL9与M2 marker基因MMP12的表达模式也是不一致的（图4E）。这些结果表明，所有肺癌肿瘤中的TAMs都显示了强大且均一的M2基因图谱。

结果3：单细胞RNA-seq揭示了具有双M1和M2特征的TAM亚群

接下来，作者希望确定TAM群体到底是M1或M2表型不同比例细胞的混合物(这是大多数之前的文献所表明的)，还是单个TAM细胞可能同时表达M1和M2特征。作者对额外两名早期肺癌患者的肿瘤和邻近正常肺组织分离的纯化巨噬细胞群进行单细胞RNA-seq分析（约9000个细胞，分成8个clusters；图五A）。发现在NTAMs上调的因子主要富集到正常组织的Cluster1和Cluster4细胞中，而在TAMs上调的因子主要富集到肺癌组织的Cluster2和Cluster3细胞中（图五BC）。此外，作者发现M2-like基因signature在两个TAM富集的Cluster（Cluster2和Cluster3）中均上调，而M1-like的signature只在cluster 3细胞中上调（图五D-F）。并且在bulk水平发现，富集在cluster 3细胞中的基因与STAT1（已知的主要调节因子介导对IFN-γ的反应，并参与激活M1相关基因的表达）呈现共表达（图五G）。这些数据证明了M1相关基因和M2相关基因可以在同一个细胞中表现出很强的共表达现象。作者又通过共聚焦显微镜（Confocal microscopy）实验发现M1-like和M2-like各自的经典marker（CXCL9 and MMP12）在TAMs肿瘤中发生了共表达，而在NTAMs肿瘤中却表现出较低的表达水平（图五H）。这些发现表明存在具有双M1和M2特征的TAM亚群（即Cluster2和Cluster3），其中一个亚群（cluster 3）表现出M1和M2双特征上调（称M1 hot），而另外一个亚群（cluster 2）仅表现出M2特征上调（称M1 cold）。

图 5

结果4：M1 hot亚群的TAMs与T细胞反应相关

为了探索M1 hot亚群的TAMs的抗肿瘤免疫功能，作者选择M1 marker基因CXCL9将bulk样本分为3类：M1 hot (top 25%)，M1 int (25%-75%)，M1 cold (bottom 25%)（图六A）。连同NTAMs肿瘤，作者发现CXCL9, CXCL10 等 M1 marker基因在M1 hot的TAMs（而非M1 cold的TAMs）中要显著高于NTAMs肿瘤，而CD209, MMP12等M2 marker基因在M1 hot和M1 cold的TAMs中都要显著高于NTAMs肿瘤（图六ABC）。接下来，作者对M1 hot和M1 cold的TAMs肿瘤进行差异表达分析，共识别到222个差异表达的转录本（图六D）。IPA pathway分析发现，M1 hot上调的转录本主要参与抗肿瘤T细胞免疫反应相关pathway，例如：TH1 T细胞招募（表达更高的CCL5, CXCL9, CXCL10以及CXCL11）, 抗原呈递, T细胞扩张, 效应T细胞的毒性与分化（图六E）。此外，发现M1 hot肿瘤比M1 cold肿瘤更高的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞密度（图六F）。GSEA分析发现，M1 signature基因富集到高CD8+ T细胞的肿瘤中，而M2 signature基因却没有呈现出与CD8+ T细胞的相关性（图六G）。这些数据表明，在行使M2功能时，M1 hot TAMs可能参与了T细胞的招募和增殖，因此可以塑造抗肿瘤反应的质量或规模。

图 6

结果5：M1 hot亚群的TAMs与改善患者生存相关

在这节当中，作者首先通过免疫染色的方式确定基于CXCL9表达水平分组 M1 hot TAMs的方式是靠谱的（图七A），比如说免疫组化M1 hot的患者具有与更高水平的CXCL9表达和CD8+ T细胞密度（图七BC）。已知CXCL9是表达CXCR3的T细胞的一种已知的趋化剂，作者通过比较分析也发现其正向相关性，共聚焦显微镜实验发现二者在T细胞膜上共定位（图七DE）。接下来，作者在一套独立验证集（n=393, 南安普顿大学医院搜集，基于CXCL9免疫组化分组）和TCGA 肺腺癌（n=495,基于CXCL9 RNA-seq分组）进行生存分析，均发现M1 hot与更好的生存相关（即高表达或高丰度的CXCL9与患者更好的预后相关）（图七FG）。进一步，作者在TCGA肺腺癌中发现，CXCL9表达与CXCR3表达呈现很强的正向相关性，并且CXCR3也与患者更好的预后相关（图七HI），这证实了上述的发现。这些结果表明 M1 hot 状态通过招募更好的抗肿瘤TIL反应进而表现出与患者更长生存的相关性。

图 7

结果6：M1 hot亚群的TAMs通过摄取脂肪酸来维持TRM细胞

在这套搜集来的队列中（n=393），作者分别通过CXCL9（M1 marker）和CD103（TRM marker）免疫组化状态将患者分组，分别是M1 (M1 hot、M1 int、M1 cold)和TRM (TRM high、TRM int、TRM cold)。通过比较分析发现TRM high的患者更倾向于属于M1 hot类，并且TRM low的患者更倾向于是M1 cold类（图八A）。此外，作者通过比较M1 hot和M1 cold分组中肿瘤浸润CD8+ T细胞的转录本（与TRM相关的基因）表达水平，发现上调的转录本也在M1 hot患者中高表达（图八B）。并且连同TRM signature基因、细胞周期以及细胞毒性/细因子signature基因均更倾向于富集到M1 hot上调基因集中（图八C）。这些结果表明M1 hot是与TRM相关的。

图 8

接下来，作者评估了M1 hot TAMs如何影响或调节TRM在肿瘤微环境中的反应。通过分析发现，M1 hot TAMs呈现出更低的脂肪酸结合蛋白（FABP3, FABP4 and FABP5）的表达水平（图八D）。众所周知，为了在组织中生存，TRM细胞依赖于通过FABP4/5摄取必需营养脂肪酸。并且研究表明，IL-4 （M1 cold因子）处理的巨噬细胞会增加其脂肪酸摄取。因此，作者假设M1 cold的TAMs会比M1 hot的TAMs在肿瘤微环境中更有效地竞争脂肪酸（由于高表达FABP3, FABP4 and FABP5），并因此在这一必需营养素的竞争中胜过TRM细胞，从而损害了肿瘤中TRM细胞的长期维持。

为了验证这一假设，作者用IFN-γ/LPS和IL-4处理血源性巨噬细胞(BDMs)，以分别模拟M1 hot和M1 cold TAMs。通过比较分析发现，与M1 cold-like的BDMs (IL-4)相比，M1 hot-like的BDMs (IFN-γ和LPS)显示出脂肪酸摄取减少（图八E）。这个现象在通过siRNA敲除脂肪酸结合蛋白（FABP3, FABP4 and FABP5）的实验中也得以呈现。此外，通过血液中提取的M1 hot-like的BDMs、M1 cold-like的BDMs分别与CD8+CD103+ T细胞进行共培养，发现当CD8+CD103+ T细胞与M1 hot-like的BDMs与共培养时，表现出更强的脂肪酸摄取（图八F），而其他的T细胞却并未呈现类似的现象。这个实验表明，M1 cold TAM可能通过细胞间对脂质营养物质的竞争的机制减少肿瘤中TRM细胞的生存和维持。

四

结语

这篇文章是比较典型的单细胞数据结合bulk数据，生物信息分析结合实验的分析。本文最大的亮点是识别了一个具有M1和M2双特征的肿瘤相关巨噬细胞的亚群，并将其与患者生存、T细胞扩张、特别是组织驻留记忆T细胞的生长维持直接挂钩。很好的揭示了它们之间的内在联系和分子机理，逻辑也比较清晰，为肺癌肿瘤相关巨噬细胞对肿瘤微环境的影响提供新的视角。

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END

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撰稿 ▎小明

排版 ▎XX