多平台单细胞数据集整合分析发Cancer cell！

2022-12-28 11:51:43, 橘子

今天给大家分享一篇2022年12月12日发表在Cancer cell(IF:38.585)上，非小细胞肺癌中组织驻留中性粒细胞的多样性和可塑性有关的文章。

High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer

非小细胞肺癌中组织驻留中性粒细胞的多样性和可塑性

一

研究背景

非小细胞肺癌(NSCLC)具有高度分子异质性和不同的免疫细胞浸润模式，这与治疗敏感性和耐药性有关。然而，对不同患者亚群中免疫细胞表型如何变化知之甚少。在这个工作中，作者通过整合来自29个数据集的318例患者的556个样本的1,283,972个单细胞，高分辨率地解析NSCLC肿瘤微环境。作者将患者分层为ID型、B型、T型和M型。他们使用具有基因组和临床信息的bulk RNA-seq数据，确定了与肿瘤组织学和基因型相关的细胞组分。

然后，作者重点分析了组织驻留中性粒细胞(TRNs)，并揭示了在微环境中获得新功能新特性的不同亚群，为TRNs的可塑性提供了证据。最后，作者还发现TRNs相关的基因与anti-PD-L1治疗疗效差相关。

二

研究结果

1、核心NSCLC单细胞图谱的生成以及UKIM-V数据集映射

作者首先通过整合29个数据集的scRNA-seq数据，产生了NSCLC核心单细胞图谱(图1A)。总体而言，核心单细胞图谱集成了898,422个单细胞，包括169,223个上皮细胞，670,409个免疫细胞，以及58,790个基质和内皮细胞(图1B)，这些细胞被注释为12种主要细胞类型和44种细胞亚型。此外，相对于10X，Smart-seq2等其他平台，通过BD-Rhapsody平台测序的UKIM-V数据集，捕获到更多的中性粒细胞 (图1C，1D)。

作者使用scArches算法，将NSCLC核心单细胞图谱作为参考数据集，对UKIM-V数据集进行映射 (图1E)。他们发现LUSC中中性粒细胞的比例明显更高，而LUAD中巨噬细胞、CD4+ T细胞、2型肺泡细胞、过渡型棒状细胞/2型肺泡细胞(transitional club/AT2)更为丰富(图1F)。为了验证研究结果，作者采用110例NSCLC患者的外部队列进行验证，并对中性粒细胞、CD4+ T细胞和巨噬细胞进行免疫组织化学染色，证实了上述发现(图1G)。

图1：核心NSCLC单细胞图谱

2.不同的NSCLC肿瘤免疫表型

接下来，作者根据TME的浸润模式对NSCLC患者进行分层，共得到四种不同的肿瘤免疫表型:(1)免疫沙漠肿瘤亚型(ID：即没有明显的免疫细胞浸润，但癌细胞分数很高);(2) B细胞肿瘤亚型(B：以B细胞、浆细胞、肥大细胞为主);(3)髓系细胞肿瘤亚型(M：巨噬细胞、单核细胞为主);(4) T细胞肿瘤亚型(T：CD8+T, CD4+T，Treg) (图2A)。

为了识别基于肿瘤细胞TME的浸润模式的特征，作者接下来分析了四种免疫表型中的差异富集通路，发现ID亚型雄激素通路明显下调 (图2B)。此前，雄激素受体信号通路已被证明可以抑制肝细胞癌中的PD-L1转录，并可能因此发挥免疫激活作用。

然后，作者应用CytoSig算法来识别每种免疫表型肿瘤细胞中富集的细胞因子信号特征(图2C)。正如预期，ID组中的大多数细胞因子信号都下调了;只有免疫抑制调节剂白细胞介素-4 (IL-4)显著升高(图2C)。他们发现M组中干扰素I-III型信号显著上调，这表明巨噬细胞/单核细胞在TME中干扰素信号传导中起着特别重要的作用(图2C)。

图2：NSCLC中的肿瘤免疫表型

3. 细胞互作分析揭示TME的异质性

作者利用CellPhoneDB进行细胞互作分析LUAD和LUSC肿瘤微环境之间配体-受体互作的差异(图3A)。作者发现，在LUAD中肿瘤细胞与中性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞、肥大细胞和经典树突状细胞之间的KDR-VEGFA信号轴显著上调，这可能与免疫抑制相关，以及LUAD中上调MARCO和ADGRE5-CD55信号通路均与迁移和侵袭相关。相反，LUSC肿瘤细胞上调SPP1以及JAG1-NOTCH信号通路，从而促进肿瘤进展，并通过中性粒细胞募集等方式调节肿瘤免疫微环境。

接下来，作者还研究了T型、B型、M型和ID型中肿瘤细胞的配体差异性表达。虽然大多数趋化因子在ID亚组中下调，但在B型、M型和T型亚组显示了几种趋化因子(CXCL9/10/11, CCL3/13/18)上调，这表明肿瘤细胞分泌的趋化因子有助于免疫浸润(图3B)。

图3：肿瘤微环境细胞互作分析

4. 整合bulk RNA-seq数据解析基因型-免疫表型之间的关联

在这里，作者使用Scissor算法整合NSCLC scRNA-seq和bulk RNA-seq以及基因型数据进行深度分析，发现EGFR、TP53、KRAS和STK11突变组中显示出不同的免疫浸润(图4A-4D)。例如，在EGRF突变的LUAD患者中具有高cDC浸润，但在KRAS和STK11突变的LUAD患者中具有较低cDC浸润。

接下来，作者还使用Scissor算法分析了其与生存的关系。总体而言，伴有丰富的B细胞的NSCLC患者与生存率的改善具有显著相关性，而富含中性粒细胞则具有较差的生存(图4E)。为了支持该发现，作者使用基于bulk RNA-seq数据的反卷积算法，并证实B细胞确实与更好的预后相关 (图4F)。最后，对CD8+ T细胞亚型的分析表明，naïve CD8+ T细胞可显著提高生存率 (图4G)。

图4：单细胞数据与基因型和生存率的关联

5. TME中的TRN具有新特性和功能

作者在此对NSCLC中肿瘤相关中性粒细胞（TANs）和癌旁中性粒细胞（NANs）的转录组特征进行了描述(图5A，5B)。他们通过流式细胞术分析(图5C)和免疫组化 (图1G)在两个外部队列中证实了LUSC中的中性粒细胞富集。TANs表型的特征是OLR1 (LOX-1)、VEGFA、CD83、ICAM1和CXCR4的高表达，CXCR1、CXCR2、PTGS2、SELL (CD62L)、CSF3R和FCGR3B (CD16B)的低表达(图5D)。

相对于TANs，NANs高表达中性粒细胞成熟标记基因(SELL, PTSG2, CXCR2, CXCR1, FCGR3B, MME)以及典型中性粒细胞标记基因(S100A8, S100A9, S100A12)(图5D)。相反，TANs呈现老化耗竭表型，低表达SELL (CD62L)和CXCR2 (图5D)和高表达中性粒细胞激活基因CD83(抑制性免疫检查点)，非典型趋化因子受体CCRL2, ICAM1 (CD54)，和C15orf48以及几种细胞因子(CCL3, CCL4L2, CCL4, CXCL2)(图5D)。

中性粒细胞通过释放VEGF等促血管生成因子促进癌症血管生成。作者证明了中性粒细胞是NSCLC TME中VEGFA表达的主要来源(图5E)。此外，过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARG)和OLR1（编码LOX-1）在TANs中表达升高(图5F)。同时，进行流式细胞术分析，证实TANs中LOX-1 (OLR1)表达升高(图5G)。并且通过流式细胞术在蛋白水平上进一步验证TANs特征基因，包括CD83和CD54 (ICAM1)的表达升高，CD181 (CXCR1)、CD62L (SELL)和CD16的表达降低(图5G)。最后，作者还进行了多重免疫荧光染色，发现LOX-1中性粒细胞浸润在肿瘤组织中，但在癌旁组织中并没有发现这一现象(图5H)。

图5：在scRNA-seq中鉴定组织驻留中性粒细胞

6. TRN的表型分析

首先，作者将NANs分为3个亚群，TANs分为4个亚群(图6A)。其中NAN-1群高表达激活促炎中性粒细胞的标记物S100A12和NETosis辅助因子PADI4,以及促血管生成标记物(PROK2, MMP9)。NAN-2群与NAN-1簇非常相似，但一些NAN-1特异性基因(如S100A12, PADI4, MMP9)表达减少。NAN-3呈现出干扰素刺激基因(GBP1, GBP5, IFIT2)的高表达(图6B)。TAN-1显示出高表达IL1RN，以及RIPK271和CD44，调节细胞募集和粘附 (图6B)。TAN-2簇的特征是 MHC II类基因HLA-DRA、CD74、HLA-DMB和HLA-DRB1的表达，表明该表型具有免疫原性抗原呈递特征 (图6B)。随后，通过流式细胞术分析发现，与NANs相比，TANs上调HLA-DR表达，证实了抗原呈递表型(图6C)。TAN-3亚簇的特征是促炎细胞因子(C15orf48, CCL3, CCL4, CSTB)和LGALS3的高表达，这与中性粒细胞的激活和迁移有关(图6B)。最后，TAN-4显示出核糖体基因的高表达(如RPS12、RPL3、RPN2、RPL23)(图6B)。

RNA速率分析表明从NAN-3到NAN-2和NAN-1的转变以及NAN-3和NAN-2分别转变为TAN-2和TAN-1, TAN-1和TAN-2转变为所有TANs子类型(图6D，6E)。接下来，作者研究了TRNs各个亚群与CD8+ T细胞和肿瘤细胞的相互作用，揭示了NANs与TANs的不同信号传导(图6F)。在所有TANs亚群中，都发现VEGFA信号上调，再次强调了其促血管生成作用，以及SPP1信号上调，表明其免疫抑制和促迁移作用。

首先作者定义了TRN特征基因，并且其在其他细胞中具有非常低的水平表达(图6G)。并且，他们发现TRN特征基因在不同TRN亚群间的表达呈异质性(图6H)。作者使用了来自POPLAR（atezolizumab治疗队列）和OAK（docetaxel治疗队列）的bulk RNA-seq进行整合分析发现TRN特征基因与anti-PD-L1治疗疗效差显著相关(图6I，图6J) ，但在docetaxel治疗队列中则不显著(图6K)。

图6：NSCLC中组织驻留中性粒细胞亚型

三

总结

这篇文章到这就分享结束了，小编认为有很多值得我们学习的地方！！！随着单细胞技术的火速兴起，各种癌症的单细胞数据越来越多，这正是我们大显身手的时候！该研究，整合近年来发表的非小细胞肺癌单细胞数据，以及自产的新平台单细胞测序数据对非小细胞肺癌肿瘤微环境进行了高精度的解析，并且发现了LUAD与LUSC中具有不同程度的中性粒细胞浸润。随后，对肺癌中的中性粒细胞进行了详细表征，并且发现其与肺癌的免疫检查点抑制剂治疗疗效差有关。为肺癌的免疫检查点抑制剂的联合治疗提供了新的理论依据！

END

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撰稿 ▎橘子

排版 ▎小北

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