AAV药物关键质量分析

2022-12-27 12:05:58, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司


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AAV药物关键质量分析

AAV全称腺相关病毒,属于细小病毒科的一类很特殊的病毒,它的尺寸非常小,只有20多个纳米,相当于两三个抗体分子,因其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,成为目前基因治疗领域应用最为广泛使用的载体之一。


AAV病毒分为2类:

①AAV(无包膜的单链DNA病毒,基因组4.7kbp) 病毒复制:Rep78、Rep68、Rep52、Rep40;病毒衣壳:VP1、VP2、VP3;指导基因组的复制和病毒载体组装:ITRs。

②rAAV(重组AAV是人工改造的AAV)删除编码病毒蛋白的基因,保留ITRs;使得包装容量最大化;降低免疫原性和细胞毒性。


AAV药物关键质量分析:

  • 衣壳蛋白鉴别及纯度:毛细管电泳 ,LC MS

    AB SCIEX的PA800 Plus毛细管电泳制药分析系统亦可对AAV的不同组装状态进行分析。由于AAV衣壳表面的氨基酸侧链会造成AAV具有特定的等电点(Isoelectric Point,pI),其内部核酸的填充情况也会造成AAV等电点的差异,同时不同的血清型也可影响产品的等电点,所以通过用等电聚焦电泳模式对AAV载体进行pI值检测可用于AAV的种类鉴别及组装情况的分析。


    毛细管电泳还可进行AAV的衣壳蛋白纯度分析及宿主细胞残留DNA(HCD)的片段分布检测。AAV衣壳由三种结构蛋白(VP1、VP2和VP3)组成,其比例和纯度都会影响药物的效能和效价,需要被鉴定并监控以确保药物质量,且AAV产品具有多种血清型,普遍浓度较低,需要一种针对不同血清型均具有较高分离度和灵敏度的分析方法。PA800 Plus采用激光诱导荧光的检测方式对AAV衣壳蛋白的结构蛋白进行纯度检测,可将VP1、VP2、VP3进行基线分离,检出限可达1×109 GC/mL。

    FDA关于人类基因治疗新产品生产指导文件中明确指出HCD的片段要小于200 bp;NMPA生物制品药学部同样在基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则的征求意见稿中指出,HCD的片段要小于200 bp。PA800 Plus用激光诱导荧光的检测方式可检测10pg/mL的DNA片段浓度, 若在前处理的过程中对DNA进行浓缩处理,还可获得更高的检测灵敏度,同时可检测50bp-1000bp的片段大小,且可进行条件优化检测长至15kb的片段大小,满足各种残留DNA检测的要求。


  • 使用液相色谱和质谱来表征腺相关病毒(aav)颗粒中的vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白以及aav组合物的纯度的方法。

  • 所述aav颗粒经受液相色谱,其中通过质谱和/或紫外(uv)-可见光光谱测定vp1衣壳蛋白、vp2衣壳蛋白和vp3衣壳蛋白的质量和比率。在一些方面,通过质谱测定所述衣壳蛋白的单独质量。在一些方面,所述aav颗粒上的衣壳在所述液相色谱的柱上变性为单独的vp1、vp2和vp3蛋白。在一些方面,通过所述液相色谱来分离所述衣壳蛋白。

  • 另外,病毒衣壳蛋白需要由正确的蛋白序列制成,并且它们通常需要加上特定的翻译后基团才能在细胞中充分发挥活性。这方面质量研究,可通过肽图分析方法进行检测。通过液相色谱与串联质谱联用(LC-MS / MS)可完成相关肽图分析,它可绘制出AAV颗粒在细胞中发挥正常功能所需的主要蛋白质序列和翻译后修饰信息。


  • 宿主蛋白残留, LC-MS  

  • 特定工艺相关残留(如亲和配基,BSA,PEI,去污剂,辅助病毒:HPLC ELSD,HPLC CAD HPLC-MS




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