知识的力量 | STTT 高分教程：如何提高CAR-T效力以及持久性

「实体瘤CAR-T 新进展」

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胸膜和腹膜转移伴恶性胸腔积液(MPE)或恶性腹水(MA)常发生于晚期肺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤和卵巢癌的患者。CAR-T作为一种新兴的肿瘤治疗方法已经在血液瘤治疗中取得突破疗效，然而在实体瘤特别是在胸腹腔恶性积液的免疫抑制环境中，CAR-T受到免疫抑制并导致细胞失能。

2022年11月19日，四川大学王永生及李丹共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy（STTT, IF=38）在线发表题为“A PD-L1-targeting chimeric switch receptor enhances efficacy of CAR-T cell for pleural and peritoneal metastasis”的研究论文。

该研究证明了MPE/MA中的免疫抑制环境导致二代CAR-T细胞杀伤功能出现障碍（图1），然后研究者发现PD-L1在病人的MPE/MA细胞中广泛表达（图2），基于这一特性， 研究者设计了一种新型PD-L1靶向嵌合转换型受体（PD-L1.BB CSR）（图3），可以和PD-L1结合并将抑制信号转化为4-1BB的胞内转导信号，4-1BB作为常用的CAR-T共刺激分子，激活后将增强T细胞IL-2, IFN-γ的分泌以及增殖。当PD-L1.BB CSR与靶向HER2的二代CAR（HER2.28ζ CAR）共表达时就构成了一种新型的双靶点以及双共刺激信号的CAR（HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR，图3&4）。

图1. 不同二代CAR-T细胞与病人胸水共培养后出现杀伤功能障碍

图2.不同病人恶性胸腹水样本（CD45-/CD45+细胞）中PD-L1都有不同程度的表达（l）,正常Dornor T细胞与不同病人恶性胸腹水共培养后PD-L1的表达上调（m）

图3. 不同CAR的慢病毒载体结构示意图

图4. Novocyte流式细胞仪检测不同CAR的表达

PD-L1.BB CSR修饰的二代CAR-T在培养基和MPE/MA中均表现出优越的适应性和增强的杀伤功能，利用xCELLigence RTCA系统评估CAR-T细胞的实时连续杀伤，HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T展现出更强的杀伤能力（图5），利用Novocyte流式细胞仪检测HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T在培养基和MPE/MA中均有更高的TCM（中央记忆T细胞）比例，提示HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T有更强的效力以及更加持久的抗肿瘤作用（图6）。

在体内异种移植小鼠模型中HER2.28ζ/PD- L1.BB CAR-T更加快速持久的清除胸膜（A549-Luc）和腹膜转移瘤(SKOV3PDL1-Luc)，并在输注30天后实现所有小鼠Tumor-free（图7）。

进一步研究证明，PD-L1.BB CSR 参与上调 HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T 细胞中的T细胞活化、细胞毒性和增殖相关基因表达。其中PD-L1 scFv和4-1BB胞内结构域对PD-L1.BB CSR修饰的二代CAR-T细胞的功能改进起重要作用。

图5.xCELLigence RTCA系统评估CAR-T细胞的实时连续杀伤，HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T展现出更强的杀伤能力

图6. Novocyte流式细胞仪检测不同CAR-T TCM（CD45RO+CCR7+）亚群比例，HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T与MPE共培养后也展现更高的TCM比例

图7. HER2.28ζ/PD-L1.BB CAR-T输注30天后完全清除腹腔CDX模型小鼠体内的SKOV3PDL1-Luc肿瘤细胞

总之，该研究揭示了基于复杂肿瘤环境对传统二代CAR-T优化的必要性，作者根据胸腹膜种植转移患者的PD-L1广泛表达的免疫抑制肿瘤环境，设计了PD-L1.BB CSR修饰的双靶CAR-T，显著提高了传统二代CAR-T的适应性。基于该研究，一项I期临床试验在胸膜或腹膜转移患者中启动(NCT04684459)，有望于通过局部输注治疗胸腹腔复发的晚期肿瘤病人并延长生存期（图8）。

图8. 胸腔/腹腔积液中CAR-T细胞的模拟治疗作用图

总结

值得一提的是，本研究中安捷伦Novocyte 流式细胞仪的应用贯穿整个研究过程，从体外研究样本到临床样本以及动物实验样本，Novocyte均交出了完美的结果；同时本研究还应用了xCELLigence RTCA实时细胞分析仪，区别于传统终点检测方法学实验，RTCA可以实时连续以及特异性的检测靶细胞的杀伤。安捷伦细胞分析产品以创新角度助力抗癌新药研发，并提供更广泛的解决方案，与研究者一样我们同样期待并致力于更有效的新药面世!