知识分享荟 | 你的DNA动了吗？

化学合成：柱合成法

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化学合成方法发展至今，寡核苷酸合成的主要化学反应发生在采用固相亚磷酰胺化学的自动化仪器中，该化学反应由 Marvin Caruthers 在1980年代首次开发。

现今使用的化学法合成DNA均利用固相亚磷酰胺法，延伸方向为3'' 端至5'' 端，该方法通常包括四个步骤：首先通过使用三氯乙酸去除DMT，核苷亚磷酰胺脱保护。其次新的DMT与5'' 羟基偶联，形成亚磷酸三酯。第三步将所有未反应的5'' 羟基乙酰化。 第四步加碘氧化，将亚磷酸酯转化为磷酸酯。同时，针对不同的应用，可以采用多种不同的策略在寡核苷酸中引入修饰，使其获得不同的功能。

该方法通常以10到100 nmol的规模同时合成96-384长度的寡核苷酸。多年来，原材料、自动化、加工和纯化方面的改进使得常规合成高达约100 nt 的成本约为每个核苷酸0.05-0.15美元，且合成的错误率小于0.5%。

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化学合成：微阵列合成法

该方法在1990年代初由昂飞发明，昂飞开创性的使用了光活化化学在空间进行定位的方法，为DNA微阵列的开发铺平了道路。如今，研发人员已经开发出多种DNA微阵列合成技术。如在利用喷墨打印技术在阵列表面合成寡核苷酸、基于半导体的电化学酸生产技术。

基于微阵列的寡核苷酸合成的产量通常在飞摩尔级，即比传统的柱合成低两到四个数量级，这种较低的合成规模导致合成所需的试剂量随之减少。再加之每个芯片具有数万的合成密度，与柱合成相比，基于芯片的每个碱基的合成成本降低了2-4 个数量级。

酶促合成法

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自 1960 年代以来，末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 是用于从头合成DNA的最有前途的DNA聚合酶之一。 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)是一种聚合酶，对核苷酸底物的特异性低，且不依赖模板，可不加选择地将脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)添加到ssDNA的3'' 端，是一种相对廉价且快速合成长ssDNA的方法。

然而，在 1980 年代成功建立亚磷酰胺方法后，人们对开发酶促DNA合成的兴趣有所下降。近年来，由于需要更快地合成更长的DNA链用于数据存储和合成生物学，而TdT在DNA合成的长度与速度上均有着显著的优势，TdT再次引起了广泛关注。

总之，寡核苷酸的合成方法中化学合成法的初产物通过纯度较低，且纯化难度大，纯化设备和成本大大限制了寡核苷酸化学合成的研发与用于。相对来讲，酶促合成法可以得到产率更高更长的寡核苷酸，不过实验受到酶专一性的限制，探索其最佳实验条件往往也是科研人员的一大挑战。