Mol Cell | 钙调神经磷酸酶信号通过在核外围去磷酸化Top2B来调节神经元活动诱导的DSB形成

2022-12-14 19:23:11, Qi

撰文 | Qi

神经元活动触发早期反应基因 (ERG) 和晚期反应基因 (LRG) 的快速转录，而活动依赖性基因转录的产物介导神经元形态和突触组织的持久变化，且神经元活动依赖性转录程序的中断被认为是包括重度抑郁症、精神分裂症等在内的多种神经系统疾病发展的基础【1,2】。因此，正确理解神经元活动依赖性转录是如何协调的非常重要。

之前的工作表明活动诱导的DSB（DNA双链断裂）由II型拓扑异构酶、拓扑异构酶IIb (Top2B) 产生，并在神经元ERG子集的启动子中富集，敲除Top2B会减弱神经元活性依赖的DSB形成和ERG转录，而ERG启动子内的DSB形成足以诱导它们的转录【3, 4】。尽管这些结果描述了一种促进ERG快速转录的新机制，但神经元活动究竟如何导致Top2B在特定基因组位点形成DSB尚不清楚。

近日，来自德克萨斯大学西南医学中心的Ram Madabhushi团队在Molecular Cell杂志上发表了一篇题为 Calcineurin signaling regulates the formation of neuronal-activity-induced DNA breaks by dephosphorylating topoisomerase IIb 9at the nuclear periphery 的文章，他们报道了磷酸酶钙调神经磷酸酶对Top2B的神经元活性依赖性去磷酸化，刺激Top2B的DNA切割活性并诱导其在小鼠的初级皮质神经元和海马中形成DNA DSB。他们表明钙调神经磷酸酶和Top2B之间的相互作用在核外周内被划分，并且导致神经元活动诱导的DSB的基因也优先聚集在核外周。这些结果为信号机制和染色质的空间组织如何调节神经元中的基因活动模式提供了新的见解。


为了破译将神经元刺激与活动诱导的DSB形成联系起来的分子事件，作者首先将培养的原代皮层神经元与已建立的各种离子通道和钙源抑制剂一起孵育，并评估它们对ERG转录和水平的影响，结果显示NMDAR活性主要调节受刺激神经元中Top2B介导的DSB形成。为了弄清楚NMDAR如何触发DSB，作者将培养的原代皮层神经元与各种激酶和磷酸酶的抑制剂一起培养，其中，用选择性钙调神经磷酸酶抑制剂（CaNi）处理后可特异性阻断NMDA处理后γH2AX水平的升高但并不改变基线γH2AX水平，表明CaN促进神经元活动诱导的DSB的形成。免疫沉淀实验结果显示Top2B以依赖于神经元活动的方式与CaN物理相互作用，暗示CaN可能直接影响Top2B的DNA切割活性。为了验证这一点，作者在体外将纯化的重组Top2B和CaN-CaM复合物与超螺旋质粒DNA一起孵育，正如预期，Top2B与超螺旋质粒的孵育增加了松弛DNA的形成。

基于CaN能特异性的激活Top2B而非Top2A的DNA切割活性，作者想知道是否是由于Top2A和Top2B的不同C端结构域（CTD）造成的这种差异，尤其是该区域内未被表征功能的众多磷酸化位点。利用神经元进行体外激酶测定发现酪蛋白激酶II（CKII）与Top2B共孵育时，可以很容易检测到32P在Top2B上的结合。进一步的靶向质谱分析结果显示Top2B在六个不同的丝氨酸残基S1453、S1509、S1511、S1537、S1539和S1568处磷酸化的动态变化，它们都位于Top2B的CTD内。需要注意的是，在CaNi存在下，这些位点的活动依赖性去磷酸化在很大程度上受到抑制，尤其是S1509和S1511两个位点。

为了确定CaN对Top2B介导的DSB形成的影响是否对ERG转录具有重要意义，作者用CaNi和Top2B毒物ETP预孵育神经元以诱导没有钙调神经磷酸酶活性的DSB，并分析了它们对ERG转录的影响。ERG转录诱导在单独存在CaNi的情况下减弱，但同时用CaNi和ETP治疗神经元能够恢复ERG转录。这些结果表明，CaN介导的Top2B对DNA切割的刺激对于ERG的转录诱导至关重要。

图1. 引起活动诱导的DSB的位点优先定位于神经元的核外周。

需要注意的是，NMDA处理触发了CaN向核外围的快速动员，在刺激后5-10分钟内可以检测到CaN簇。核外围的CaN富集持续到20分钟，在初始刺激后的40到60分钟，CaN染色在核外再次增加，并且CaN在外围的定位也与gH2AX灶点的出现相吻合。为了进一步了解CaN和Top2B在核外围的优先相互作用如何与神经元活动诱导的DSB的形成相关，作者用荧光核苷酸标记法对含有不同小鼠基因座的细菌人工染色体(BACs)克隆进行标记，并将标记的探针与抗laminA/C抗体一起用于免疫FISH实验。对来自包含ERG、Fos、Npas4和FosB的探针的FISH信号进行分析发现这些基因座都优先定位于核外围。

综上所述，这项工作为神经元刺激后调节DSB的形成机制提供了重要见解，刺激特异性钙信号驱动CaN使Top2B去磷酸化，从而刺激其DNA切割活性，并诱导其形成活性依赖性DSB，而定位于核外围的这种位置特异性是通过两种不同的机制赋予的：（1）引起神经元活动诱导的DSB的位点优先定位于核外围，并且Top2B在基础条件下已经与这些位点结合；（2）神经元活动触发CaN快速重新定位到核外围，从而诱导Top2B形成DSB。总之，这些结果揭示了径向基因定位和活动依赖性信号的划分如何控制活动诱导的 DSB 的位置和时间以及如何调节神经元中的基因活动模式。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.09.012


制版人：十一


参考文献


1. Ebert, D.H., and Greenberg, M.E. (2013). Activity-dependent neuronal signalling and autism spectrum disorder. Nature 493, 327–337. https://doi.org/10. 1038/nature11860.
2. Nestler, E.J., Pen˜ a, C.J., Kundakovic, M., Mitchell, A., and Akbarian, S. (2016). Epigenetic basis of mental illness. Neuroscientist 22, 447–463. https://doi.org/ 10.1177/1073858415608147.
3. Madabhushi, R., Gao, F., Pfenning, A.R., Pan, L., Yamakawa, S., Seo, J., Rueda, R., Phan, T.X., Yamakawa, H., Pao, P.C., et al. (2015). Activity-induced DNA breaks govern the expression of neuronal early-response genes. Cell 161, 1592–1605. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.032.
4. Stott, R.T., Kritsky, O., and Tsai, L.H. (2021). Profiling DNA break sites and transcriptional changes in response to contextual fear learning. PLoS One 16, e0249691. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0249691.
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