抗体偶联药物(ADC)研究的好帮手

2022-12-13 23:24:45, 陈老湿德国赛多利斯集团

近年来，抗体疗法在多种疾病的新疗法的发现中展现出不俗的实力。在癌症治疗领域，抗体偶联药物（ADC）的研究如火如荼。ADC利用单克隆抗体（mAbs）的特异性，通过将细胞毒性药物直接传递到表达特征标记或抗原的肿瘤细胞，实现靶向细胞死亡。乳腺癌临床用药Kadcyla® 是由靶向HER2的曲妥珠单抗（赫赛汀®）与细胞毒性药物伊美坦辛（DM1）偶联的ADC药物。

其作用机制（MoA）如下：

DM1定向转运至HER2阳性细胞
曲妥珠单抗介导HER2信号通路的抑制作用
抑制HER2胞外结构域从细胞膜上脱落
抗体介导的ADCC作用

其中第一项机制基于抗体与细胞表面HER2的高效结合及药物内化后引起的DM1分子胞内释放。基于此，考察ADC药物的结合、内化和毒性实验是研发环节中必不可少的，而这些动态变化的过程均可由Incucyte® 实时活细胞分析系统捕捉并完成分析。

Kadcyla®结构示意图

抗体内化

方法：

Incucyte® Human Fabfluor-pH Antibody Labeling Dye可通过一步法特异性标记人IgG的Fc段，其pH敏感性可实现：被标记的复合物与特定的表位结合后被细胞内化，进入低pH值的溶酶体环境中，pH值的变化导致染料产生荧光，结合Incucyte® 使抗体内化过程可视化。

加入标记后的抗体药物12小时后，Kadcyla® 与曲妥珠单抗均在HER2阳性乳腺癌细胞AU565中表现出较高的内化水平（较IgG阴性对照组及低HER2表达的MDA-MB-231细胞组）。6 μg/mL Kadcyla®组在< 6 h时已进入平台期。Kadcyla® 与曲妥珠单抗24小时 EC50值分别为0.38 μg/mL，0.22 μg/mL，两者表现出类似的结合特异性及内化效应。

细胞增殖

方法：

Incucyte® Nuclight Green Lentivirus 试剂使AU565细胞稳定表达绿色的核荧光信号。Incucyte® 可实时捕捉图像，分析细胞核数量以表征细胞增殖状态。

Kadcyla® 中的DM1是一种微管蛋白抑制剂，可抑制微管的组装，导致细胞周期的中断，从而导致有丝分裂停止，然后死亡。当Kadcyla® 内化到溶酶体中时，DM1被裂解并释放到细胞中，并发挥作用。

在药物作用72小时后，Kadcyla® （1.5 μg/mL）组的细胞显现出不健康的细胞形态，且其增殖明显被抑制（较IgG阴性对照组及曲妥珠单抗组）。Kadcyla® 对细胞增殖的抑制作用的IC50为0.24 μg/mL，与内化效价相似，并显示出与喜树碱相当的最大细胞杀伤作用。使用细胞健康指示剂Incucyte® Annexin V Dye （0.30 μg/mL，数据未显示）测定的Kadcyla® 细胞凋亡效价一致。

细胞周期

方法：

Incucyte® Cell Cycle Lentivirus 试剂使AU565细胞稳定表达G1期及S/G2/M期荧光指示剂，该试剂不影响细胞正常功能。在S/G2/M期细胞核呈绿色荧光；在M至G1期细胞核无色；在G1期细胞核呈红色荧光；在G1至S期细胞核呈黄色（绿色与红色叠加）荧光。Incucyte® 可实时捕捉图像，Incucyte® Cell-by-Cell模块可分析不同颜色细胞核数量以表征细胞周期状态。

在正常情况下的AU565细胞周期不同时相细胞百分比的表现为绿色（S/G2/ M, 40±3%）、红色（G1, 24±2%）、黄色（G1/ S, 15±2%）或无色（M/G1, 20±4%）。经Kadcyla®（3 μg/mL）处理的AU565细胞在最初24小时内，红色细胞减少（下降至13%），无色细胞增加（上升至27%），表明在M/G1期周期停止。36 h时，图像主要显示绿色细胞（24%）和非荧光细胞（52%），再加上它们越来越圆的形态，表明在周期停滞发生在有丝分裂阶段附近。48小时后，细胞形态看起来不健康，正在死亡。而同型对照IgG或曲妥珠单抗（数据未显示）的影响甚微。

ADCC

方法：

稳定表达绿色核荧光信号的AU565靶细胞与NK细胞以5：1的效靶比于不同浓度Kadcyla® 样本组中共培养。培养基中加入Incucyte® Annexin V NIR Dye以表征细胞凋亡信号。Incucyte® 可实时捕捉图像，分析靶细胞数量及凋亡信号以表征ADCC效应。为了展示Kadcyla® 的综合疗效，将其通过常规ADCC（与直接杀伤结合使用）杀死靶细胞的能力与其在单一培养中的直接细胞毒性作用（ monoculture）进行了比较。

在单培养和共培养孔中，绿色荧光均出现药物浓度相关的下降，表明Kadcyla®处理的靶细胞死亡。从图像中可以明显看出，在NK存在的情况下，附加的ADCC效应比单独的直接细胞毒性效应更强。ADCC对靶细胞的杀伤速度更快，作用强约25倍（EC50：直接细胞毒0.27 μg/mL, ADCC为0.011 μg/mL）。Annexin V信号也展示了类似的数据。96 h时的数据表明ADCC共培养模型对靶细胞的清除有所改善，这与Kadcyla®对肿瘤细胞清除的高临床疗效一致。

为了进一步了解Kadcyla® 在ADCC 实验中的生物学作用，使用iQue® 人NK细胞杀伤试剂盒结合iQue® 高通量流式细胞仪平台分析NK细胞的激活状态。

Kadcyla®在24小时和48小时诱导CD3-CD56+ NK细胞上CD25表达明显的浓度依赖性增加，表明NK细胞被激活。
Kadcyla®还可诱导NK细胞CD16水平的降低。CD16脱落与NK细胞的激活有关，在ADCC过程中，CD16脱落参与了NK细胞和靶细胞的分离，并可能导致连环效应。
Kadcyla®处理后IFNγ分泌也有浓度依赖性增加，表明其与NK激活有关。

以上数据支持Kadcyla® 在NK细胞存在的情况下处理HER2表达的靶细胞，导致NK细胞的激活，从而诱导ADCC效应。

综上所述，Incucyte® 活细胞分析系统在 Kadcyla® 作为ADC药物的应用实例，该分析方法能够对Kadcyla® 的抗体内化、细胞增殖、细胞周期及ADCC效应进行简单、清晰的可视化和量化。

Kadcyla® 可特异性结合HER2表达细胞，内化效率和效力与曲妥珠单抗相似。

与曲妥珠单抗不同，Kadcyla® 一旦内化，通过释放细胞毒性负载DM1(一种有效的微管蛋白抑制剂)导致细胞定向死亡。

Kadcyla® 介导的ADCC活性和直接杀伤的联合作用提高了清除肿瘤细胞的效率。