Nature Comms | 西湖大学Kiryl Piatkevich和郭天南团队发表可“膨胀”的空间蛋白质组学新技术详解

2022-12-01 10:42:21, 西湖欧米wOmics 西湖欧米（杭州）生物科技有限公司

图1 文章标题

文章思路

（1）建立 ProteomEx 方法流程；

（2）ProteomEx 流程性能测试及与其他方法比较；

（3）ProteomEx 技术用于 AD 小鼠大脑切片的空间蛋白质组异质性探索。

文章结果详解

建立 ProteomEx 方法流程

本研究提出了一种便捷且易于使用的手动组织微解剖方法与 bottom-up 基于质谱的蛋白质组学方法相结合，该方法名为 ProteomEx，可用于评估组织中蛋白质组的空间异质性。

ProteomEx 的具体流程为：

1. 研究者优化出一种膨胀水凝胶材料，可用作放大组织及保持机械稳定性；

2. 将组织中的蛋白质通过小分子化合物可逆锚定到水凝胶聚合材料网络；

3. 组织样本在水凝胶的带动下各同向性扩张；

4. 组织染色；

5. 在显微镜下对样本进行微解剖；

6. 胶内酶解和多肽提取；

7. 4D DIA-MS 高灵敏度蛋白质组质谱数据采集。

图2 ProteomEx 空间蛋白组学流程

ProteomEx 的创新优势

通过将样本放大以实现精确微解剖，被锚定到水凝胶上的样本可以在线性维度上最大放大8倍，相当于体积放大512倍，便于根据精细的解剖/组织学特征或器官（亚）区域对感兴趣的区域进行手动显微解剖。

ProteomEx 流程性能测试及

与其他方法比较

图3 ProteomEx 流程性能测试

ProteomEx 前处理方法多肽产率高，漏切率低

1. 方法比较：ProteomEx vs 溶液内酶解 vs PCT压力循环技术 vs proExM-MS；

2. 实测数据：在多肽回收率上，ProteomEx 相比其余3种方法提高了1.4-1.7倍，其约为72.450±6.17 μg 多肽/mg组织；同时，ProteomEx 能得到更低的漏切率（20.4±1.0%）；

3. 结果分析：ProteomEx使用的膨胀方法能为酶分子更好地进入蛋白质酶切位点提供途径。

图4 ProteomEx 前处理方法多肽产率高，漏切率低

ProtemEx 蛋白鉴定量高，重复性好

1. 方法比较：ProteomEx vs 溶液内酶解 vs PCT压力循环技术 vs proExM-MS；

2. 实测数据：每个样本取200 ng多肽，将通过不同前处理方法的多肽样本在 timsTOF Pro 上进行 DDA 采集，ProteomEx 能得到3818个蛋白，与其余几种方法得到的结果类似，证明这些方法均有较好的重复性。通过比较这四种方法得到的蛋白鉴定量，研究发现 overlap 为56.6%（通常 DDA 采集模式下，典型 overlap 处于50-60%之间），表明 ProteomEx 流程处理方法得到的结果与其余方法相当。此外，以上4种方法蛋白质在分布上也较为类似。研究使用直径为3 mm的穿刺取样针（相当于膨胀前500 μm直径，5.9 nL组织）进行组织活检，通过与空白凝胶样本做对照（462多肽/132蛋白），每个样本鉴定到24437多肽/3541蛋白。

图5 ProtemEx 蛋白鉴定量高，重复性好

ProteomEx 样本用量极限的探索

1. 实测数据：通过处理实际体积约为0.6、2.4、5.4、9.6和15.0 nL（相当于横向分辨率为160、320、480、640和800 μm）的小鼠脑组织切片，分别鉴定到2987、15,705、23,989、35,160和37,071条多肽，分别对应928、3044、4203、5058和5105种独特蛋白质；

2. 结果分析：研究在最低体积的测试中与PCT方法做了对比，PCT技术作为处理小微量样本的代表性方法，能够有效分析0.2-1 μL范围内的组织体积，比ProteomEx高了3个数量级，而ProteomEx在处理小体积样品时能够表现出更高的重现性，表明ProteomEx方法为蛋白质组学的亚纳升体积分析提供了一种新策略。

ProteomEx 样本兼容性良好

1. 样本兼容性好：通过使用 ProteomEx 技术对三种不同的小鼠组织类型进行处理，包括脑、肝和乳腺癌样本。研究发现各向同性良好，即膨胀均一；

2. 染色兼容性好：为探索质谱与染色方法的兼容性，研究采用 DAPI 和 Aβ 抗体对 AD 小鼠大脑切片进行染色，使用 ProteomEx 对齐进行成像和处理，对于2.52 nL的免疫染色组织，在3个重复中鉴定了对应~2000种蛋白质的~7000条多肽，证明其兼容性良好。

图6 ProteomEx 样本兼容性良好

ProteomEx 最大可膨胀512倍

实测数据：经测试得，ProteomEx 技术最大可线性膨胀8倍，即体积比原来扩大512倍，使用直径为1 mm的穿刺取样针得到的样本实际体积为0.37 nL样本, 在 PulseDIA 模式下可鉴定到超过3000条多肽和1000种蛋白质。

图7 ProteomEx 最大可膨胀8倍

ProteomEx 技术用于 AD 小鼠大脑

切片的空间蛋白质组异质性探索

1. 小鼠模型：野生型和AD模型（APP/PS1）与不同年龄层包括年轻组、老年组，共12只小鼠；

2. 区域选定：皮层（Cortex，V1），海马CA1区（hippocampal field CA1，CA1）,海马CA3区（hippocampal field CA3，CA3），齿状回（dentate gyrus，DG）和内侧膝状复合体（medial geniculate complex，MGC）区域；

3. 取样针规格：2 mm内径直径的穿刺取样针；根据各个区域空间定位，代表性取样2-3处，共得到144个凝胶样本；

4. 质谱技术：PulseDIA；

5. 鉴定深度：共鉴定到6215个蛋白；

图8 ProteomEx 应用实验流程

6. 分析结果：从年龄层次来看，在年轻（5月龄）小鼠的大脑蛋白质组表达在 AD 与对照组中差异并不显著，而老年（18月龄）组别中则有明显差异。因此，后续分析主要针对老年组小鼠的疾病组与对照组进行比较；

在老年小鼠组别中，AD 小鼠大脑的蛋白质组学改变因不同区域而异。从区域水平上，海马体中共有73个差异蛋白, 而皮层中只有6个，MGC 中只有1个，这些发现与先前报道 AD 的主要病变发生在海马体的研究一致。研究发现 STXBP2、APOE 和 CLU 在皮层和海马体中重叠，但在 MGC 中不重叠，APOE 和 CLU 蛋白之前与 AD 进展相关联。STXBP2 只有少数研究发现其在大脑中的表达，但没有文献数据报告其与 AD 的关联。本研究揭示了它在 AD 中的潜在参与。

图9 AD小鼠中的空间蛋白质组学

进一步对海马区进行亚区划分，分别探索了CA1、CA3 和 DG 区域的疾病组与对照组的蛋白质组表达差异。其中 CA1 的改变最为显著，有198个差异蛋白，其次是 CA3 区域的19个差异蛋白，而 DG 区域则无显著差异。结果表明 AD 病变的变化不是在整个海马体扩散，而是在海马区的 CA1 和 CA3 的亚区。本研究发现，STXBP2 和 APOE 是多个区域的共有差异蛋白，再次证明了 STXBP2 的关键作用。以上结果均表明，ProteomEx 工作流程能够有效研究AD的病理空间异质性。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34824-2

编译：江燕

审校：李璐，刘晶晶

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送样建议

样本类型	切片厚度
FFPE 蜡块	西湖欧米可负责切片
FFPE 切片	5-15 μm，推荐10 μm最佳
OCT 包埋组织块	西湖欧米可负责切片
OCT 切片	推荐10 μm
PFA 组织块‍	西湖欧米可负责切片
PFA 切片	推荐30 μm
新鲜组织	西湖欧米可负责包埋成 FFPE/OCT，或固定成 PFA，再进行相应切片