肿瘤相关中性粒细胞高分思路分享

张泽民教授“Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”这篇肝癌肿瘤微环境异质性的文章，首次在单细胞精度定义了肝癌的五种免疫微环境亚型，首次全面揭示肿瘤相关中性粒细胞(TAN)的异质性，通过百万细胞数据揭示中性粒细胞的“叛变”，发现肿瘤相关中性粒细胞才是关键！那么肿瘤相关中性粒细胞到底是怎样的存在呢？还不清楚的小伙伴戳链接了解详情（点击跳转原文）。

今天我们的主题是肿瘤相关中性粒细胞高分研究思路。

肿瘤相关中性粒细胞（TANs）

个性化生信分析思路

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在Cell杂志上发表的一项研究（PMID: 33098771）表明，中性粒细胞在进入组织后会获得新的特性，这些特殊功能有助于维护器官的健康。当然，这也体现了为什么肿瘤中中性粒细胞存在异质性。今天通过一篇发表在Gut（IF: 31.793）上的文章向大家展示肿瘤相关中性粒细胞的研究思路。

这篇文章在胰腺导管癌癌（PDAC）肿瘤微环境中发现了一个促肿瘤中性粒细胞亚簇，揭示了TANs中高糖酵解活性和促肿瘤功能之间的关联，表明缺氧诱导和内质网应激诱导的BHLHE40激活是驱动TANs向促肿瘤表型发展的潜在机制。

下面是分析过程，基于单细胞RNA-seq数据和TCGA数据采用多种分析方法以及实验技术方法，揭示PDAC肿瘤微环境中的中性粒细胞异质性以及潜在机制。

一、分析外周血和PDAC肿瘤的中性粒细胞的单细胞景观，并通过细胞间通信分析显示，在肿瘤微环境中，中性粒细胞和巨噬细胞之间存在密切的串扰

1、实验工作流程图(图1A)；

2、UMAP图展示通过单细胞RNA-seq确定的主要细胞类型，样本来自健康对照组、慢性胰腺炎患者和PDAC患者的外周血的CD66b+多形核白细胞（PMN）vs PDAC患者的CD45+免疫滤液(图1B)；

3、点图描述了PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞和其他细胞之间选择的配体-受体相互作用。通过CellPhoneDB计算平均表达式和p值，并分别用圆圈颜色和大小表示(图1C)；

4、Bar图描述了PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞和其他细胞之间显著的配体-受体相互作用的数量(图1D)；

5、PDAC组织CD66b和CD68的免疫荧光染色(图1E)；

6、基因集合富集分析（GSEA）显示了TANs中TNFα和IL-1通路的富集分数。基于PDAC患者的PMN和TANs的单细胞RNA-seq数据进行通路富集分析(图1F)；

图1

二、来自PDAC肿瘤的TANs是由一个异质性群体组成的，轨迹分析显示中性粒细胞最终分化为促肿瘤的TAN-1状态

1、UMAP图显示来自PDAC患者的PMN亚群和TANs亚群。所有来自PDAC肿瘤组织的被注释为中性粒细胞的细胞都被分析为TANs，包括图1B中的中性粒细胞簇1和2(图2A，B)；

2、展示每个亚群中中性粒细胞表达谱之间的Pearson相关系数。计算每个亚聚类中前2000个高度可变基因的平均归一化表达量，并进行Pearson相关分析(图2C)；

3、小提琴图显示TAN-1亚簇、TAN-2亚簇、TAN-3亚簇和TAN-4亚簇的标记基因(图2D)；

4、不同中性粒细胞亚群之间的通路活性的比较(图2E)；

5、中性粒细胞在二维空间中沿伪时间的轨迹(图2F)；

6、基因表达随伪时间的动态变化的热图，这些基因根据功能通路富集差异被分为三组(图2G)；

7、使用qPCR展示THG、IL-1β、TNFα和缺氧24小时后中性粒细胞样dHL-60细胞中TAN-1标记基因的表达(图2H)；

图2

三、TAN-1与PDAC患者较差的预后相关

1、对PDAC组织上中性粒细胞（CD66b）和TAN亚群的标记基因（VEGFA为TAN-1，TAN-2为NLRP3，MME为TAN-3，IFIT2为TAN-4）的免疫荧光染色和IHC(图3A，B)；

2、根据VEGFA+ TANs的百分比，将患者平均分为两组，展示总生存期的Kaplan-Meier生存曲线，VEGFA+ TAN high组的预后更差(图3C)；

3、根据GSVA检测TCGA队列和其他验证队列每个样本中TAN-1标记基因的表达情况，将患者平均分为两组，显示总生存期的Kaplan-Meier生存曲线，TAN-1 signature high组的预后更差(图3D，E)；

四、代谢分析显示TANs中的糖酵解转换，主要在TAN-1中上调，增强了TANs中的促肿瘤功能

1、展示每个中性粒细胞亚群中HALLMARK糖酵解和缺氧特征表达的Box图（左图），以及特征中基因平均归一化表达的热图（右图）(图4A)；

2、二维图显示糖酵解特征和缺氧特征沿伪时间轨迹的动态表达(图4B)；

3、流式细胞术分析PDAC组织中LGALS3+和LGALS3-TANs中GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA的表达(图4C)；

4、肿瘤、邻近肿瘤和间质区域的中性粒细胞富集点的空间特征图。采用单样本基因集富集的方法（ssGSEA）计算每个空间点的中性粒细胞特征，根据单细胞测序鉴定的中性粒细胞标记基因进行分析，将中性粒细胞特征排名前10%的斑点定义为中性粒细胞(图4D)；

5、Box图显示肿瘤、邻近肿瘤和基质区域中中性粒细胞富集点的糖酵解特征(图4E)；

6、基于转录组学(F)和蛋白质组学(G)数据使用GSEA显示TANs中HALLMARK糖酵解途径(图4F，G)；

7、PMN和TAN裂解物中糖酵解中间体的代谢组学分析(图4H)；

8、糖酵解途径示图，其中红色框表示TANs中代谢物明显增加(图4I)；

图4

五、对上游调控因子的分析显示，BHLHE40驱动中性粒细胞向促肿瘤表型发展

用单细胞调控网络推理和聚类（SCENIC）评估驱动TANs异质性的上游转录因子（调控因子），BHLHE40作为TAN-1的标记基因之一，是TAN-1中上调最显著的转录因子之一。

1、UMAP图显示BHLHE40在TANs中的表达情况（左图），以及BHLHE40在TANs中的调节活性估计的曲线下面积（AUC）评分（右图）(图5A)；

2、通过SCENIC展示BHLHE40的代表性调控网络(图5B)；

3、通过qPCR进行分析BHLHE40细胞在对照组和BHLHE40过表达的dHL-60细胞中BHLHE40靶点的表达情况(图5C)；

4、通过染色质免疫沉淀qPCR分析BHLHE40在dHL-60细胞中靶基因启动子区的结合(图5D)；

5、在THG和/或HYP刺激24小时后，通过qPCR进行分析对照组和BHLHE40敲除的dHL-60细胞中BHLHE40靶点的表达(图5E)；

图5

6、与BHLHE40过表达的dHL-60一起培养的PDAC细胞的增殖和迁移能力显著增强(图6A，B)；

7、BHLHE40过表达的dHL-60细胞对CD8+ T细胞的促炎细胞因子的产生和增殖均有抑制作用，表明BHLHE40可能是髓系源性抑制细胞（MDSCs）的潜在调节因子(图6C，D)；

8、IHC分析显示，BHLHE40+中性粒细胞和表达PDAC标记基因VEGFA的中性粒细胞在PDAC微环境中共定位(图6E)；

9、BHLHE40+中性粒细胞高浸润水平与更差的预后密切相关(图6F)；

图6

上面这篇文章使用了生信+实验的方式多方面展示了TANs的异质性以及相应的调控机制，值得我们学习和参考。当然，小编经过文献调研也大致总结了其他几个方向：

1、WGCNA+预后signature

2、聚类分型+免疫治疗

3、单细胞+bulk RNA-seq高分思路

4、单细胞互作分析……等等

总之，简单的、复杂的TAN的分析思路生信人都有，就看大家更倾向于哪种了。如果对生信不够了解，不太能意会到小编的意思，也可以扫描下方二维码进行更细节的沟通。

肿瘤相关中性粒细胞（TANs）

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