肿瘤相关中性粒细胞高分思路分享

2022-11-30 10:50:19, CC


张泽民教授“Liver tumor immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity”这篇肝癌肿瘤微环境异质性的文章,首次在单细胞精度定义了肝癌的五种免疫微环境亚型,首次全面揭示肿瘤相关中性粒细胞(TAN)的异质性,通过百万细胞数据揭示中性粒细胞的“叛变”,发现肿瘤相关中性粒细胞才是关键!那么肿瘤相关中性粒细胞到底是怎样的存在呢?还不清楚的小伙伴戳链接了解详情(点击跳转原文)。


今天我们的主题是肿瘤相关中性粒细胞高分研究思路


肿瘤相关中性粒细胞(TANs)

个性化生信分析思路

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在Cell杂志上发表的一项研究(PMID: 33098771)表明,中性粒细胞在进入组织后会获得新的特性,这些特殊功能有助于维护器官的健康。当然,这也体现了为什么肿瘤中中性粒细胞存在异质性。今天通过一篇发表在Gut(IF: 31.793)上的文章向大家展示肿瘤相关中性粒细胞的研究思路。



这篇文章在胰腺导管癌癌(PDAC)肿瘤微环境中发现了一个促肿瘤中性粒细胞亚簇,揭示了TANs中高糖酵解活性和促肿瘤功能之间的关联,表明缺氧诱导和内质网应激诱导的BHLHE40激活是驱动TANs向促肿瘤表型发展的潜在机制。


下面是分析过程,基于单细胞RNA-seq数据和TCGA数据采用多种分析方法以及实验技术方法,揭示PDAC肿瘤微环境中的中性粒细胞异质性以及潜在机制。


一、分析外周血和PDAC肿瘤的中性粒细胞的单细胞景观,并通过细胞间通信分析显示,在肿瘤微环境中,中性粒细胞和巨噬细胞之间存在密切的串扰


1、实验工作流程图(图1A);


2、UMAP图展示通过单细胞RNA-seq确定的主要细胞类型,样本来自健康对照组、慢性胰腺炎患者和PDAC患者的外周血的CD66b+多形核白细胞(PMN)vs PDAC患者的CD45+免疫滤液(图1B);


3、点图描述了PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞和其他细胞之间选择的配体-受体相互作用。通过CellPhoneDB计算平均表达式和p值,并分别用圆圈颜色和大小表示(图1C);


4、Bar图描述了PDAC肿瘤微环境中中性粒细胞和其他细胞之间显著的配体-受体相互作用的数量(图1D);


5、PDAC组织CD66b和CD68的免疫荧光染色(图1E);


6、基因集合富集分析(GSEA)显示了TANs中TNFα和IL-1通路的富集分数。基于PDAC患者的PMN和TANs的单细胞RNA-seq数据进行通路富集分析(图1F);


图1


二、来自PDAC肿瘤的TANs是由一个异质性群体组成的,轨迹分析显示中性粒细胞最终分化为促肿瘤的TAN-1状态


1、UMAP图显示来自PDAC患者的PMN亚群和TANs亚群。所有来自PDAC肿瘤组织的被注释为中性粒细胞的细胞都被分析为TANs,包括图1B中的中性粒细胞簇1和2(图2A,B);


2、展示每个亚群中中性粒细胞表达谱之间的Pearson相关系数。计算每个亚聚类中前2000个高度可变基因的平均归一化表达量,并进行Pearson相关分析(图2C);


3、小提琴图显示TAN-1亚簇、TAN-2亚簇、TAN-3亚簇和TAN-4亚簇的标记基因(图2D);


4、不同中性粒细胞亚群之间的通路活性的比较(图2E);


5、中性粒细胞在二维空间中沿伪时间的轨迹(图2F);


6、基因表达随伪时间的动态变化的热图,这些基因根据功能通路富集差异被分为三组(图2G);


7、使用qPCR展示THG、IL-1β、TNFα和缺氧24小时后中性粒细胞样dHL-60细胞中TAN-1标记基因的表达(图2H);


图2


三、TAN-1与PDAC患者较差的预后相关


1、对PDAC组织上中性粒细胞(CD66b)和TAN亚群的标记基因(VEGFA为TAN-1,TAN-2为NLRP3,MME为TAN-3,IFIT2为TAN-4)的免疫荧光染色和IHC(图3A,B);


2、根据VEGFA+ TANs的百分比,将患者平均分为两组,展示总生存期的Kaplan-Meier生存曲线,VEGFA+ TAN high组的预后更差(图3C);


3、根据GSVA检测TCGA队列和其他验证队列每个样本中TAN-1标记基因的表达情况,将患者平均分为两组,显示总生存期的Kaplan-Meier生存曲线,TAN-1 signature high组的预后更差(图3D,E);


图3


四、代谢分析显示TANs中的糖酵解转换,主要在TAN-1中上调,增强了TANs中的促肿瘤功能


1、展示每个中性粒细胞亚群中HALLMARK糖酵解和缺氧特征表达的Box图(左图),以及特征中基因平均归一化表达的热图(右图)(图4A);


2、二维图显示糖酵解特征和缺氧特征沿伪时间轨迹的动态表达(图4B);


3、流式细胞术分析PDAC组织中LGALS3+和LGALS3-TANs中GLUT1、HK2、PFKFB3和LDHA的表达(图4C);


4、肿瘤、邻近肿瘤和间质区域的中性粒细胞富集点的空间特征图。采用单样本基因集富集的方法(ssGSEA)计算每个空间点的中性粒细胞特征,根据单细胞测序鉴定的中性粒细胞标记基因进行分析,将中性粒细胞特征排名前10%的斑点定义为中性粒细胞(图4D);


5、Box图显示肿瘤、邻近肿瘤和基质区域中中性粒细胞富集点的糖酵解特征(图4E);


6、基于转录组学(F)和蛋白质组学(G)数据使用GSEA显示TANs中HALLMARK糖酵解途径(图4F,G);


7、PMN和TAN裂解物中糖酵解中间体的代谢组学分析(图4H);


8、糖酵解途径示图,其中红色框表示TANs中代谢物明显增加(图4I);


图4


五、对上游调控因子的分析显示,BHLHE40驱动中性粒细胞向促肿瘤表型发展


用单细胞调控网络推理和聚类(SCENIC)评估驱动TANs异质性的上游转录因子(调控因子),BHLHE40作为TAN-1的标记基因之一,是TAN-1中上调最显著的转录因子之一。


1、UMAP图显示BHLHE40在TANs中的表达情况(左图),以及BHLHE40在TANs中的调节活性估计的曲线下面积(AUC)评分(右图)(图5A);


2、通过SCENIC展示BHLHE40的代表性调控网络(图5B);


3、通过qPCR进行分析BHLHE40细胞在对照组和BHLHE40过表达的dHL-60细胞中BHLHE40靶点的表达情况(图5C);


4、通过染色质免疫沉淀qPCR分析BHLHE40在dHL-60细胞中靶基因启动子区的结合(图5D);


5、在THG和/或HYP刺激24小时后,通过qPCR进行分析对照组和BHLHE40敲除的dHL-60细胞中BHLHE40靶点的表达(图5E);


图5


6、与BHLHE40过表达的dHL-60一起培养的PDAC细胞的增殖和迁移能力显著增强(图6A,B);


7、BHLHE40过表达的dHL-60细胞对CD8+ T细胞的促炎细胞因子的产生和增殖均有抑制作用,表明BHLHE40可能是髓系源性抑制细胞(MDSCs)的潜在调节因子(图6C,D);


8、IHC分析显示,BHLHE40+中性粒细胞和表达PDAC标记基因VEGFA的中性粒细胞在PDAC微环境中共定位(图6E);


9、BHLHE40+中性粒细胞高浸润水平与更差的预后密切相关(图6F);


图6




小结


上面这篇文章使用了生信+实验的方式多方面展示了TANs的异质性以及相应的调控机制,值得我们学习和参考。当然,小编经过文献调研也大致总结了其他几个方向:


1、WGCNA+预后signature



2、聚类分型+免疫治疗



3、单细胞+bulk RNA-seq高分思路



4、单细胞互作分析……等等




总之,简单的、复杂的TAN的分析思路生信人都有,就看大家更倾向于哪种了。如果对生信不够了解,不太能意会到小编的意思,也可以扫描下方二维码进行更细节的沟通。



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