项目文章 | 脊髓损伤患者中菌群与机体的共代谢机制

●发表期刊：NEURAL REGEN RES

●发表时间：2022.10

●影响因子：6.1

近日，山东第一医科大学附属中心医院宁斌教授团队在NEURAL REGEN RES上发表了题为《Alterationsin gut microbiota are related to metabolite profiles in spinal cordinjury》的文章，该研究通过构建T8-T10创伤性脊髓损伤小鼠模型，评估了小鼠肠道菌群与脊髓代谢物之间的相关性，并探讨了肠道菌群在SCI后继发性损伤中的作用机制。迈维代谢为本研究提供了广泛靶向代谢组学及T500检测服务。

脊髓损伤(SCI)通常会导致永久性瘫痪、性功能障碍和膀胱/肠道功能障碍。共生肠道菌群的活性与多种宿主疾病的发生和发展密切相关。肠道微生物系统与宿主中枢神经系统(CNS)之间的双向交流是通过微生物-肠道-大脑轴(MGBA)实现的。最新研究表明，MGBA参与了多种中枢神经系统疾病的发病机制，但是人们对于肠道菌群与SCI的联系仍知之甚少。

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图1 

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图2

将小鼠随机分为假手术（sham）组和脊髓损伤（SCI）组（n=36/组），构建T8-T10创伤性脊椎损伤小鼠模型（图1A）。构建SCI小鼠模型后，通过并行后肢运动功能（BMS）评分（图2A）、斜板实验（图2B）和旷场实验（图2C和2D）等行为测试，来评估小鼠的运动功能，从而确定模型是否构建成功。由图可知，相较于sham组，建模后SCI组小鼠的运功功能明显受损（图2A和图2B），运动距离也明显下降（图2C和2D）。Sham组脊髓结构保持完整，无出血、坏死或炎症细胞浸润；而在SCI组中发生出血、炎症细胞浸润和神经元死亡等现象（图2E）。磁共振图像显示，SCI组小鼠的脊髓不连续（图2F）。这些现象说明建模成功，且SCI小鼠出现连续炎症反应。

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图3

为研究两组间肠道菌群是否存在差异，于建模14天后收集sham组(n= 22)和SCI组(n= 22)的粪便样本，并采用16SrRNA基因扩增子测序比较两组间粪便菌群组成。如图3A所示，在SCI组中，代表物种丰富度的Chao1指数和Observedspecied指数、代表物种多样性的Shannon指数和Simpson指数、以及物种均匀度Pielou指数均低于sham组。这表明SCI可能降低了微生物群的多样性。

为了确定小鼠肠道微生物群的差异是否由SCI导致，对两组数据进行β多样性分析。主坐标分析（图3B）和非计量多维标度分析（图3C）的结果表明，sham组和SCI组粪便样品的肠道菌群存在差异。同样，Adonis和Anosim试验也显示，各组间肠道菌群的群落结构和组成存在显著差异(图3D和3E)。这些结果说明SCI可导致肠道菌群失调。此外，采用无加权的算术均值对所有样本进行分层聚类分析，发现所有的sham样本和所有的SCI样本聚类到一起形成两个单独的组（图3F）。

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图4

根据物种注释结果，分别在门和属水平选择前10个物种分析(图4A和4B)。门水平上，SCI小鼠肠道内容物中厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)含量较高，拟杆菌门(Bacteroidetes)含量较低。厚壁菌门与拟杆菌门比值（F/B）反映肠道菌群失调的程度。SCI组中F/B值明显高于sham组(图4C和D)，说明SCI组肠道菌群失调的程度较大。在属水平上，与sham组相比，SCI组有三种菌（Lactobacillus、Allobaculum、Sutterella）的相对丰度较低，两种菌（Shigella、Bacteroides）的相对丰度较高。

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图4

为了研究不同组小鼠的共同和独特物种，使用维恩图进行群落分析。图5A显示，两组共有的微生物为5365种，分别占sham组和SCI组的的18.92%和33.50%。这表明Sham组比SCI组包含更多的独特ASVs，这一结论与图3A得到的结论一致。线性判别分析(LDA)结果（图5B）表明SCI组和sham组的菌群有显著差异。在门水平上，SCI组中厚壁菌门(Firmicutes)的含量较高，拟杆菌门(Bacteroidetes)的含量较低。在属水平上，SCI组以拟杆菌属(Bacteroides)、瑞肯菌属(Rikenella)和志贺氏菌属(Shigella)为主，而sham组以乳酸菌属(Lactobacillus)、Allobaculum和萨特氏菌属(Sutterella)为主。这些不同特征的细菌可能会以各种方式影响宿主的健康。图5C显示，SCI组中有6种微生物（葡萄球菌属Staphylococcus,棒状杆菌属Corynebacterium,志贺氏杆菌属Shigella,Odoribacter, 理研菌属Rikenella和Bacteroides）上调，3种微生物（Allobaculum,萨特氏菌属Sutterella和乳酸菌属Lactobacillus）下调。这一结果进一步证明了SCI处理对肠道菌落有显著影响。随后利用随机森林（RF）挑选biomarker（图5D）。Sham组的代表菌株有：Allobaculum,考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）,双歧杆菌属（Bifidobacterium）和萨特氏菌属（Sutterella）；SCI组的代表菌株有：葡萄球菌属（Staphylococcus）,拟杆菌属（Bacteroides）,Odoribacter,Mucispirillum和理研菌属（Rikenella）。这一结果与线性判别分析(LDA)效应量（图5B）和热图（图5C）结果一致。上述结果表明，SCI后小鼠肠道内微生物集群失调，且会伴随促炎菌群（志贺氏杆菌Shigella,拟杆菌属Bacteroides,理研菌属Rikenella,葡萄球菌Staphylococcus,Mucispirillum）的增加和抗炎菌群（乳酸菌属Lactobacillus,Allobaculum，萨特氏菌属Sutterella）的减少。基于在肠道微生物组中的发现，作者进一步测试了代谢组学，以确认SCI后局部代谢物是否发生了改变。

广泛靶向代谢组学被用于鉴定脊髓组织的代谢谱，并分析肠道菌群和这些代谢物之间的关系。

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图6

图6A和6B说明sham组与SCI组分离良好，表明SCI导致了严重的代谢功能障碍。图6C中的红色和绿色分别表示VIP>1和VIP<1的代谢物。火山图显示，上调代谢物有320个，下调代谢物有27个（图6D）。氨基酸及其代谢物、甘油磷脂、脂肪酰基和有机酸及其衍生物等代谢物有显著差异。KEGG结果表明，在所有途径中氨基酸代谢相关途径最为丰富（图6E）。结合KEGG途径富集结果，选择L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸5种代谢物作为可能在损伤部位产生一定影响的标记物。这五种代谢物过量积累，可能诱导氧化应激和炎症反应，从而参与SCI后的继发性损伤。

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图7

通过计算Spearman秩相关系数，深入研究SCI后肠道菌群变化与局部代谢物之间的潜在相关性。在属水平上对前20个差异菌群群落和前50个差异代谢物进行相关性分析，发现一些微生物和多个代谢物之间显著相关(|r|>0.6和P<0.05)(图7A)。上述微生物包含：乳酸菌属Lactobacillus,志贺氏杆菌属Shigella,Mucispirillum,萨特氏菌属Sutterella和Allobaculum等五种菌属。这五种菌属可能影响SCI后的代谢过程，并与某些代谢物的积累有关。部分氨基酸如L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸在SCI后显著增加，与志贺氏杆菌属（Shigella）和Mucispirillum呈正相关，与乳酸杆菌属（Lactobacillus）,萨特氏菌属（Sutterella）和Allobaculum呈负相关（图7B）。最后，通过T500检测这五种氨基酸的绝对含量后发现，其结果与代谢组学的检测结果一致，验证了广靶代谢组学的准确性（图7C）。综上所述，肠道菌群的变化与某些代谢物相关，这些代谢物可能加剧SCI后的炎症反应。然而，这些代谢物是否直接受变化的肠道微生物的影响，尚需进一步的研究。

SCI可导致小鼠肠道菌群严重紊乱。同时，本文发现SCI组中27种代谢物减少，320种代谢物增加。结合KEGG富集分析结果，筛选出5种差异显著的代谢物(L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸)作为可能在损伤部位产生一定影响的标志物。相关性分析结果表明，肠道菌群的改变与这五种代谢物相关。猜测可能的机制为：这五种代谢物的积累，可能激活氧化应激和炎症反应，参与SCI损伤后的继发性损伤，从而导致菌群失调。本研究结果为通过粪便微生物移植改善SCI后继发性损伤提供了新的理论依据。