2022-11-28 17:11:58 苏州镁伽科技有限公司
本期“充电”干货
质粒的构建是合成生物学 DBTL (Design-Build-Test-Learn)循环中非常耗时、费力的步骤,利用高通量自动化设备赋能质粒构建已成为当今生物学领域的研究热点之一。
近日,Nature Communications 上发表了质粒相关的最新研究成果,研究团队打造了全新的Plasmid Maker全自动质粒构建平台,该平台可以高通量无差错地构建任意长度的质粒。
关于Plasmid Maker
Plasmid Maker全自动质粒构建平台的DBTL流程:
(1) 设计:用户可以按照自己喜欢的方式排列 DNA 片段。
(2) 构建:使用液体处理器将引物、模板、预混到 96 孔板中进行PCR反应。反应结束后利用获取的扩增片段构与载体(24碱基同源臂)、野生型PfAgo酶和突变型PfAgo*酶混合,利用一锅法消化。
(3) 测试:利用液体处理设备提取质粒后进行凝胶电泳验证。
(4) 学习:这种高通量的pipeline允许通过标准化和集成单元操作完成多个孔板的DNA组装,研究人员只需要对整个系统进行监督即可。
研究亮点与差异性
不同于以往的利用限制性酶切原理进行质粒构建的自动化平台,该团队将前期开发的火球菌来源的限制酶(PfAgo)与该酶的突变体(PfAgo*)进行了验证。当识别序列的 GC 含量较低时, PfAgo表现出更高的消化效率。但是,如果识别序列的 GC 含量高于50%时,PfAgo*则拥有更高的消化效率。二者单独或混合使用可以消化广泛的具有不同GC含量的片段(0-75%),用户可以直接根据提交的表单顺序进行选择。
在进行多片段组装验证时,利用HiFi Taq DNA 连接酶,将经过PfAgo与PfAgo*消化后具有12nt粘性末端的片段进行连接发现具有极高的连接成功率。该技术技术可以实现对多达12个DNA片段的精确组装,在组装达到27kb的大质粒时仍能保持较高的成功率。
结语Ending
最终,研究团队利用研发出的高通量平台进行了大量的验证试验,总共构建了来自六个不同物种的 101 个质粒,基因长度大小从 5 到 18kb 不等,最多同时进行了11 个 DNA 片段的一步组装,进行了超过20000次自动化移液步骤,研究实现了生物设计、制造和测试周期的大幅压缩,研究人员有望从劳动密集型的实验中解放出来,将更多的时间精力用于解析基因回路和代谢途径的设计原理上。
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