Cell | 噬菌体中的CRISPR系统详解：基因编辑工具开发的新宝库

2022-11-26 14:44:28, 木兰之枻

撰文 | 木兰之枻

CRISPR-Cas系统是原核生物抵抗噬菌体及质粒等外源性遗传物质的适应性免疫系统。总体而言，CRISPR-Cas系统可分为两大类，第一大类（包括I型、III型和IV型系统）依赖多种Cas蛋白形成多亚基复合物发挥功能，第二大类（包括II型、V型和VI型系统）则依赖单一Cas效应蛋白发挥功能。近年来研究者发现，被看作是攻击对象的噬菌体中同样存在CRISPR-Cas系统，且在人源细胞和植物细胞中具有明显的基因编辑能力（Science | 更小的基因编辑工具！巨型噬菌体中的新CRISPR系统，有望带来基因编辑新革命）【1-3】，这让研究者意识到，CRISPR-Cas系统的存在或许更加广泛。

2022年11月23日，来自加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna实验室与Jillian F. Banfield实验室合作在Cell发表题为Diverse virus-encoded CRISPR-Cas systems include streamlined genome editors的论文。文章通过对大量微生物样本的宏基因组进行数据挖掘，发现所有已知类型的CRISPR-Cas系统在噬菌体中均有发现。功能实验和结构分析还指出，一种新的CRISPR-Casλ系统在哺乳动物和植物细胞中均有显著的基因编辑效率，为后续基因编辑新工具的开发提供了更多选择。

早期研究在噬菌体中发现过I-F和V型CRISPR-Cas系统，不过相关研究非常有限且缺乏系统性。如今研究者对超过660Gb的微生物宏基因组数据进行系统性分析并发现了超过6000种编码CRISPR-Cas系统的噬菌体。不过绝大多数噬菌体中的CRISPR-Cas系统并不完整，常常缺少特定的组分，这意味着噬菌体很可能会劫持宿主CRISPR-Cas系统的特定组分为己所用。总体而言，携带CRISPR-Cas系统的噬菌体占比不高（0.4%，远低于细菌的40%和古细菌的85%），但在多种类型的噬菌体中均有发现。此外，所有已知的六种CRISPR-Cas系统在噬菌体中均有分布。与细菌相比，噬菌体中的CRISPR-Cas系统也有其独特之处，如负责介导序列整合和靶向定位的相关组分缺失，III型及VI型系统的变异（变异可减弱流产感染）以及携带靶向其它移动遗传元件的间隔序列等。举例而言，部分噬菌体编码的III型CRISPR系统会靶向噬菌体尾丝蛋白或转座酶的RNA转录本；噬菌体编码的VI型Cas13系统缺少可增强流产感染的关键蛋白csx27和csx28。

依赖单一Cas效应蛋白发挥功能的第二大类（包括II型、V型和VI型系统）CRISPR-Cas系统因其基因编辑的潜力而广受关注。噬菌体中研究者发现多种包含HNH和RuvC结构域的小型化CRISPR-Cas系统。但它们通常缺少Cas1/2或Csn2等组分，且各结构域的排布也与已知Cas9不同。系统发育分析指出，噬菌体中的II型CRISPR-Cas9系统具有多重进化起源的特点，且通常是在既往感染时从其宿主中获得。研究者还注意到，噬菌体基因组中富含小型化的V型CRISPR-Cas系统，包含44个蛋白家族数百种Cas核酸酶。演化分析指出，V型CRISPR-Cas系统的不同亚型很可能是通过多重进化的方式从不同TnpB家族演化而来。研究还发现，V型CRISPR-Cas系统相关的CRISPR阵列中包含可靶向竞争性染色体外双链DNA元件（据推测可感染相同宿主）的间隔序列。此外，多种巨大噬菌体中的小型化V型CRISPR-Cas系统常与I-X型系统共存，且I-X型系统也存在靶向相同染色体外双链DNA元件的间隔序列。

研究指出，噬菌体中存在一类全新的Casλ蛋白家族，其与II型及V型系统的序列相似度非常低。目前已知该家族包含55种小型化的CRISPR-Casλ系统。系统发育分析发现，Casλ与Cas14J亲缘关系最近，但其蛋白结构域的排布与已知系统有显著不同。Casλ的CRISPR阵列中包含可靶向竞争性染色体外双链DNA元件的间隔序列，其crRNA会形成细长型的发夹结构，这种结构并不存在于Cas12系统中。此外，crRNA的5’、3’端及中央区域均存在保守序列。考虑到以上特性，研究者针对Casλ开展了更多的功能检测及结构分析。结果指出，Casλ会利用其RuvC结构域对pre-crRNA进行加工并得到成熟的crRNA，其PAM序列为TTR，并在HEK293T细胞、拟南芥以及六倍体的小麦原生质体中表现出明显的基因编辑能力。结构分析指出，尽管Casλ大小及序列相似度与Cas9及Cas12有显著差异，但结构之间依然有很高的相似性。

总体而言，本研究对噬菌体中CRISPR-Cas系统的分布情况进行了更加全面和系统的分析，拓展了我们对CRISPR-Cas系统的认识。噬菌体中新发现的CRISPR-Cas系统也为基因编辑工具的未来发展及应用提供了丰富的资源。

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.10.020

制版人：十一

参考文献

1. Pausch, P., Al-Shayeb, B., Bisom-Rapp, E., Tsuchida, C.A., Li, Z., Cress, B.F., Knott, G.J., Jacobsen, S.E., Banfield, J.F., and Doudna, J.A. (2020). CRISPR-CasF from huge phages is a hypercompact genome editor. Science 369, 333–337.

2. O’Hara, B.J., Barth, Z.K., McKitterick, A.C., and Seed, K.D. (2017). A highly specific phage defense system is a conserved feature of the Vibrio cholerae mobilome. PLoS Genet.

3. Seed, K.D., Lazinski, D.W., Calderwood, S.B., and Camilli, A. (2013). A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity. Nature 494, 489–491.