三剑客再发威，价值4200万美金的T细胞开关技术

2022-11-24 09:20:10, 陈老湿德国赛多利斯集团

众所周知，赛多利斯生物分析部门拥有知名的三剑客：Incucyte®实时活细胞分析系统、Octet®非标记分子互作系统和iQue®高通量流式细胞仪，近期又一篇同时应用三剑客的重磅文章新鲜出炉^[1]，特此撰文，以飨读者。

这篇文章发表在PNAS上，第一单位是座位于旧金山的Soteria Biotherapeutics公司，这家私人免疫肿瘤学公司专注于开发下一代可切换双特异性 T 细胞接合剂，以治疗实体瘤患者肿瘤癌症。并且于2021年5月17日，宣传完成4200万美元A轮融资，由罗氏风险基金和5AM Ventures 牵头。

“战斗部”和“引导部”分开的药物技术LITE

拿下如此多融资的技术，是怎样一种技术，该文章又是如何利用我们三剑客的呢？

图1. LITE技术示意图：大多数生物药物使用靶向结构域来定位治疗部分（第一个图）。新技术中，靶向区域与治疗区域是分离的，小分子存在时，两者组装起来发挥功能，活性受小分子剂量调节。

Octet® 验证LITE药物亲和力

Octet® 是技术验证的关键技术，作者检测小分子诱导的抗体的结合活性变化。基于先前报道的小分子药物的快速生成基于抗体的化学诱导二聚体（AbCID）系统的方法^[2]，作者构建一种口服小分子药物venetoclax，Venetoclax是BCL-2的选择性抑制剂，之后筛选到与BCL-2选择性结合，且有较强的亲和力的Fab片段AZ21（图2A）。其突变体具有可逆性，随时间解离（图2F）。利用小鼠肿瘤模型，作者验证了小分子诱导的抗体可以靶向实体瘤位置。

图2. 可逆、依赖Venetoclax(简称V)的LITE开关设计及特征：A、V/BCL2复合物抗体筛选流程图；B、在没有Venetoclax的情况下，两者无结合；C、1uM Venetoclax存在的情况下，Fab AZ21与BCL-2亲有效结合；D、小分子诱导结合具有特异性，其他小分子无法诱导结合；F、BCL-2突变体具有良好的可逆性。

之后，作者验证LITE开关可否延长治疗蛋白的半衰期，IL-2能够刺激免疫反应，是癌症免疫治疗的早期方法，由于其血清半衰期非常短（约6分钟）且有严重的副作用，很难有效地给药。作者生成靶向部件Ab03和治疗部件Ab04，且Ab03在小分子存在时有结合（图3），单一Ab03半衰期没有变化，服用Venetoclax半衰期提高到2.4h，LITE开关可大大延长生物药物治疗效果。

图3. IL-2细胞因子药代动力学调节：A、LITE系统组装流程：IL2连接AZ21；B、Ab03在Cenetoclax存在的情况下与BCL-2结合。

使用iQue® 和Incucyte® 检测LITE系统与CAR-T细胞结合杀伤效果

最后作者将LITE系统与CAR-T细胞结合杀伤HER2+癌细胞。这时候，轮到赛多利斯iQue® 和Incucyte® 出场啦！共培养体系用于检测T细胞激活情况以及细胞因子分泌情况，使用iQue® 检测激活的T细胞（CD69+）以及癌细胞杀伤的比例，分别计算Venetoclax的EC50值。后续又用Incucyte® 配合死细胞染色剂，统计共培养体系中靶细胞的杀伤情况以及暂停后再次加入时候的效果。

图4. Venetoclax调控双特异性T细胞激活：B、不同浓度Venetoclax激活T细胞的比例；C、不同浓度Venetoclax激活T细胞分泌IFNg检测；D、靶细胞杀伤情况；E、不同浓度Venetoclax加入导致对靶细胞的不同杀伤情况，Incucyte统计靶细胞死亡（红光荧光面积，归一化到0h）

综上所述，Soteria独有的T-LITE™ T细胞接合剂通过口服小分子激活剂选择性地打开，通过控制双特异性复合物形成的时间、持续时间和水平来调节有效的T细胞活性。这种可切换的活动能够精确控制T细胞重定向和细胞毒活性的时间和幅度。与缺乏控制开关并因此与显着副作用相关的传统T细胞接合剂不同，Soteria的T-LITE疗法旨在允许医生调节T细胞活性以最大限度地提高疗效，同时最大限度地减少副作用。

本文中用Octet® 进行结合动力学的测定，iQue® 进行流式细胞术实验，Incucyte®检测细胞杀伤状况，为什么Stoteria要用赛多利斯三剑客进行实验呢？

Incucyte® 实时活细胞分析系统优势：

培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害；本文中长时间短时间间隔检测激活双特异性T细胞杀伤靶细胞情况，即便微小的浓度差异，在Incucyte® 面前也无法遁形
6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高
高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；本文提到了使用Incucyte® 多个参数的调节，使得结果更加准确
大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol；文章数大于12000篇，是长时间活细胞成像产品中最多

Octet® 非标记分子互作系统优势：

非标记Direct Binding是趋势，它的结果更准确
快速测定亲和力，更加定量化对互作进行表征
无洗涤步骤，可测弱亲和力（解离快），本文Fc受体解离快，无法用带洗涤的传统方法建立结合活性检测。
测试时间短，一般10分钟，更快拿到结果！本文5分钟就可以完成实验
实验形式多样化：定性，两者结合，协同/竞争实验，垂钓
写入了美国药典，文章>10000篇，认可度广
万金油技术，可以用与检测DNA、小分子、蛋白等各种生物分子
使用方便，成本相对低

iQue® 高通量流式细胞仪优势：

采用气隙分隔吸入和样品输入，使流式细胞术进入高通量筛选(HTS)领域
最小样本体积达到10uL，支持384、1536孔板采样，96孔板只需5min
ForeCyt软件、比起传统流式更简单的使用及维护，硬件配套软件，是高通量流式筛选必备仪器。虽然在文章中未提及iQue® 的高通量应用，可以想象，在后期筛选其他小分子或者双特异性抗体元件的过程中，这也是必不可少的

赛多利斯生物分析三剑客
Incucyte® | iQue® | Octet®

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-参考文献-

[1]Martinko A J, Simonds E F, Prasad S, et al. Switchable assembly and function of antibody complexes in vivo using a small molecule[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2022, 119(9): e2117402119.

[2]Hill Z B, Martinko A J, Nguyen D P, et al. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications[J]. Nature Chemical Biology, Nature Publishing Group, 2018, 14(2): 112–117.