人参皂苷Rg1和Re的分离选择性因素的探讨

背 景

色谱学堂微信公众号2022年11月12日发布了一个人参皂苷类化合物分析的应用案例（详情请查阅

https://mp.weixin.qq.com/s/8hH9ogX_pEYvZtkDxsdeFA）。案例中的关键的一对难分离的物质是人参皂苷Rg1和Re。

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摘录部分内容进行简介：

上图来自色谱学堂公众号文章

发现相同制造工艺的色谱柱，孔径大的色谱柱分离效果好，另外一点也很重要，谱图上显示孔径大的色谱柱上保留弱。找到了关键特征后，筛选ChromCore C18 300孔径的色谱柱。结果更加，而且孔径越大，保留越弱。

上图来自色谱学堂公众号文章

初步研究

我基于自己手边的AutoChrom软件内对这个项目也做了一下功课。首先用AutoChrom的Column Compare 软件对相同厂家不同孔径的C18色谱柱进行了比较。Column Compare基于TANAKA柱效测试方法，利用精选的参考标志物对色谱柱的6项性能进行了量化评估。

首先比较了安捷伦公司的经典色谱柱SB-C18.

上图六个参数里面有几项参数有差异：300A孔径的SB-C18的疏水保留能力小于80A的色谱柱，此外氢键能力，碱性条件下的离子交换能力，数值变化大。而疏水选择性，体积选择性以及酸性条件下的离子交换能力变化小。总结一下：相同基质的色谱柱，孔径变大后疏水保留能力减弱，氢键保留能力增加，碱性条件下的离子交换能力减弱。保留能力减弱在ChromCore 色谱柱上得到了确认。

再选一组色谱柱进行比较，这次选择ACE的ACE 3 C18系列进行比较。SB-C18和ACE 3 C18的一个明显区别是其为不封端的色谱柱，裸露的硅醇基比较多。

此时也能观察到疏水保留能力减弱，氢键能力变化，碱性条件下离子交换能力变化。但其变化的幅度没有SB-C18系列变化那么大。

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进一步研究

通过应用资料的查询，查到ACE的两款色谱柱的C18色谱柱分离人参皂苷的结果的资料，一款是ACE UltraCore SuperC18 2.5μm 100×4.6mm，另一款为ACE C18-AR。其分析结果如下两图：

谱图来自广州菲罗门应用集

ACE UltraCore SuperC18 分离的分离度不完美，但分离时间的确比较短。

谱图来自广州菲罗门应用集

ACE C18-AR 色谱柱有不错得选择性，关键色谱峰的分离效果很好。

用ACD AutoChrom 的Column Compare进行比较UltraCore SuperC18和ACE 5 C18-AR。可以看到明显差异的性质包括疏水保留能力，体积选择性，氢键保留能力，酸性条件下的离子交换能力。

将以上的色谱柱特性掌握的知识进行一次综合，马上得出一个交集：疏水保留能力相对弱，氢键能力强的色谱柱可以解决人参皂苷Rg1和Re的分离问题。

疏水保留能力弱，能够让人参皂苷Rg1和Re有一个相对合适的保留因子k。药典方法是等度方法，保留强的色谱柱上Rg1和Re的k在20以上，分离度会不理想。基于分离度公式在选择性相当的情况下，k值在2-20之间分布，柱效N处于高值区，对分离度有利。

分离度公式

氢键的大小是提供选择性的重要能力，只有能提供比较强的氢键的色谱柱，才能有比较好的人参皂苷Rg1和Re的选择性。

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再进一步

星谱科技的贺文君老师向我提供了星谱科技产的色谱柱在人参皂苷分离研究的应用结果。

药典方法解读

对药典方法进行一下解读。这个方法里是有一段低比例等度，然后接一个缓梯度，然后高比例等度维持，然后再接一个梯度。从这个方法来看首先化合物的疏水性很普通，一点都不难冲洗，不应该运行这么久。其次，方法里较难分离的色谱峰就是人参皂苷Rg1和Re，而这方法的原作者很可能是想让人参皂苷Rg1和Re在等度这种分离能力最强的情况下出峰，然后走一个缓梯度，升到合适的高度后再用等度来洗脱另外的次难分离的物质。但由于C18色谱柱的保留能力其实差异很大，很对保留能力强的色谱柱人参皂苷Rg1和Re是在梯度段上出峰，白白浪费了前面的35分钟的等度铺垫，而这两个双平台多拐点方法和目标分子的出峰在很多色谱柱上根本就不适用，应进行合理的梯度设计。

再反思一下前文讨论的氢键是人参皂苷Rg1和Re选择性来源的结论。保留能力弱的色谱柱能够提供一个合适的出峰时间，能够配合上等度-梯度-等度-梯度阶段的分析方法也可能是分离关键。

很可能所有的开发者都被药典方法绑住了手脚，只有不断尝试用合适的色谱柱才能解决问题，例如色谱学堂的科学家发现大孔径的色谱柱能够提供合适的保留时间和分段梯度时间正好吻合。下图可以看到人参皂苷Rg1和Re正好在第一个等度上出峰。

物质性质研究和有关物质

保留的作用力分析

用ACD AutoChrom的pH Selector对logD进行计算人参皂苷Rg1和Re的疏水性，发现其疏水性的大小与出峰顺序相悖。也就是说单纯论疏水性的话，出峰时间不是Rg1先出，而是相反。显然有作用力改变了疏水保留能力，由于两者化合物母核极为相似，保留的变化实际上是糖单元的数量带来的氢键效应，以及糖单元的引入的体积变化的综合结果。有糖单元的存在，氢键一定不会是一个弱的作用，而是一个可以和疏水作用匹敌的作用力。

色谱柱的选择性

在AutoChrom 的Column Selection 基于色谱柱六属性，进行一次聚类分析。参与聚类的色谱柱包括ACE 5 C18, ACE 5 C18-AR, Aglient XDB C18, Agilent Extend C18, Aglient Eclipse Plus C18. 如下图可见，ACE 5 C18-AR与其他色谱柱被归于不同的分类组里。

在AutoChrom 的Column Compare软件内，打开Dataset Filter，用较弱的疏水保留能力（下限1.25，上限4.5），较强的氢键能力（下限0.65，上限1），色谱柱类型为任意为条件过滤色谱柱库，可以得到一个色谱柱列表参考，获得的色谱柱数量为38，绿框内为部分代表。

从以上列表中再挑选几个色谱柱，比如Acquity BEH Phenyl , BIOshell Pepetide C18，GraceSmart  RP18再进行聚类分析 获得以下的分簇情况。

假设保留比较弱且氢键能力强是解决人参皂苷分离的关键色谱柱属性，则分簇 1,3,4的色谱柱都可能对目标物提供更佳的选择性，分簇2 内的色谱柱的选择性较差。

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两个建议

► 建议方法开发者能够基于知识读懂药典方法，基于知识挑选高选择性色谱柱，用小粒径短柱开发出更高效的专属性强，耐用性强，时间短的色谱方法，以节约社会的资源。

► 建议药典法规方法能够加入色谱柱的知识空间，如果方法记录为C18柱，色谱方法应该在正交的C18上进行充分测试，以确保方法能够被使用者正确实践，以实际工作报效国家。

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备注

如果读者对用TANAKA方法测试色谱柱选择性参数的方法有兴趣可以联络我。以上除标记来源的谱图，其他色谱柱比较，理化性质比较都来源于ACD AutoChrom的功能组件的抓图。