干湿结合好文：单细胞助力临床研究肿瘤免疫应答相关巨噬细胞及T细胞

单细胞分析是目前的热点方向，今天小编和大家分享一篇发表在Theranostics（IF:11.600）杂志上的关于尿路上皮癌（UC）的单细胞分析文章。文章利用单细胞数据，对UC进行分型。并对不同亚型的细胞组成及交互进行了分析，同时也探索了亚型特异微环境与预后及免疫应答的关联。文章将经典的组织（bulk）数据分型思路应用到单细胞水平，这一思路值得小伙伴们参考学习。

尿路上皮癌(UC)是第四常见的肿瘤类型，包括侵袭性的上尿路上皮癌(UTUC)，以及在组织学上很常见的膀胱尿路上皮癌(UCB)。目前研究已经发现约60%的UTUC和15-20%的UCB都被诊断为肌肉浸润型(MI)，具有较差的预后。此外，免疫检查点抑制剂(ICIs)被发现对局部晚期或转移性尿路上皮癌的治疗具有重要意义，且与UCB相比UTUC对ICIs的应答率更高。因此，精确识别UC的不同亚型，对准确预测UC患者的ICI治疗获益具有重要的临床意义。

该研究对12名UTUC患者的13个组织样本进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析。并纳入一个UCB (n = 404)队列和一个UTUC (n = 158)队列的组织RNA-seq测序数据，以及一个接受阿特珠单抗治疗的转移性尿路上皮癌(mUC)队列(n = 348)对单细胞分析得到的关键结果进行分析和验证。

研究发现局部晚期UTUC中肿瘤浸润的免疫细胞比例更高。此外，研究也在UTUC和UCB中识别了预后相关的基底细胞样（basal）亚型和管腔样（lumina）亚型。进一步研究也发现basal亚型中免疫抑制巨噬细胞和耗竭T细胞亚群富集，并表现出强相互作用。此外，研究也开发了一个捕获免疫抑制巨噬细胞的基因表达特征(Macro-C3 score)来预测UC的预后及免疫治疗应答。总之，该研究揭示了UC独特的肿瘤微环境并揭示了新的免疫逃避的候选调节因子，为提高basal亚型的抗肿瘤免疫提供了潜在的治疗靶点。

在文章的第一部分，作者对UTUC的肿瘤内的异质性进行了刻画。研究从12名UTUC患者中收集了12个原发肿瘤和一个配对的肿瘤血栓共13个组织样本，用于scRNA-seq。研究还纳入了一个UCB和一个UTUC的组织RNA-seq队列，以及一组接受阿特珠单抗治疗的(mUC)队列作为验证集(图1A)。研究在对scRNA-seq数据进行质控后保留了67392个细胞，并将其聚类为22个细胞亚群(图1B，C)。

作者基于标记基因，将这些细胞亚群注释为T细胞、髓系细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞、B细胞、浆细胞和自然杀伤细胞(NK)共九个细胞亚群。接下来作者在肌肉浸润性(MI)肿瘤中观察到免疫细胞的富集程度高于非肌肉浸润性(NMI)肿瘤，而上皮细胞的比例则较低(图1F)。此外，研究分析了一个UTUC队列的组织RNA-seq数据，也观察到与NMI肿瘤相比，MI肿瘤中免疫细胞亚群的比例显著增加(图1G)。

图1 单细胞RNA测序揭示UTUC瘤间异质性

在文章的第二部分，作者对恶性细胞的亚型进行了识别。作者首先通过inferCNV推断细胞的染色体拷贝数变异(CNVs)，识别了31152个恶性细胞。接下来使用47个基因panel，根据表达谱，将MI UTUC样本识别为lumina和basal亚型(图2A)。此外，作者也发现这47个panel基因中的SPINK1基因在lumina型UTUC中表达上调，但在basal亚型中没有。免疫组化也表明SPINK1的高表达，因此作者推测SPINK1可能是UTUC的潜在lumina亚型特异性生物标志物(图2B)。作者使用这47个panel基因，也定义了两个计算得分：basal得分和luminal得分，来量化这两个亚型。

在UTUC组织测序队列中，作者发现basal评分与疾病特异性生存率(DSS)下降显著相关，而单因素分析则发现luminal评分与DSS升高显著相关(图2C)。此外，使用TCGA数据也发现，basal评分和lumina评分能够预测MI UCB的预后。为了进一步探索MI UTUC亚型的基因表达模式，作者在这两种亚型的肿瘤细胞中识别出521个差异表达基因(DEGs)(图2D, 2E)，并对这些基因进行GO富集分析，结果发现lumina亚型中上调的基因富集于与上皮细胞发育相关的通路。basal亚型中上调的基因则在免疫调节通路中富集(图2F)。此外，研究也观察到与lumina亚型相比，basal亚型中参与调节髓样细胞分化的基因富集，且免疫逃避基因表达上调(图2F和2G)。

图2 基于47个面板基因对MI UTUC分型

这一部分作者由于发现basal和lumina型肿瘤细胞在髓样分化和迁移的调控方面存在差异(图3A, 3B)，因此对UTUC中的髓系细胞进行分析。此外，由于巨噬细胞是髓系细胞中的一个主要细胞类型，因此重点分析巨噬细胞。研究在巨噬细胞中未观察到传统促炎(M1)和抗炎(M2)亚群的标记基因(图3C)。进一步研究发现了一个巨噬细胞亚群(Macro-C3)在basal亚型中显著富集(图3D)。

作者观察到该亚群高表达与CD8+ T细胞招募相关的基因以及免疫检查点和免疫逃逸基因(图3B)，且与其他巨噬细胞相比，Macro-C3中免疫耐受诱导相关基因表达上调(图3E)。在识别了一个亚型相关的巨噬细胞子集后，作者开发了一个主要由与免疫抑制相关的基因组成的Macro-C3特征(图3F)，并将该特征应用到UTUC组织测序队列，结果发现与scRNA-seq数据集一致，basal亚型的Macro-C3特征评分明显高于NMI和luminal亚型(图3G)。此外，作者也发现UTUC组织队列中较高的Macro-C3特征评分与DSS和无进展生存期(PFS)降低显著相关(图3H)。

图3 basal亚型中免疫抑制巨噬细胞累积

接下来，作者对T细胞和NK细胞进行无监督聚类分析，结果识别了一个naïve T细胞亚群、2个CD4+ T细胞亚群、3个CD8+ T细胞亚群和2个NK细胞亚群共8个亚群(图4A-C)。这3个CD8+ T细胞亚群分别为：一个耗竭的CD8+T细胞亚群（CD8- c1）(图4B和4C)；一个高表达GZMK的细胞亚群（CD8- c2）；以及一个表达干扰素刺激基因的亚群（CD8- c3）(图4B)。 

CD4+ T细胞分别为一个调控(CD4- c1)以及一个耗竭CD4+ T细胞亚群(CD4- c2)(图4B)。接下来为了确定T细胞的发育轨迹，作者进行了伪时间分析。结果观察到CD4+ T细胞起源于naïve T细胞，接着分化为CD4- c1及CD4- c2。而CD8+ T细胞的发育轨迹则是从naïve状态开始，经过CD8- c2，并以CD8- c1结束。接下来，研究也发现naïve T细胞在basal亚型中的相对比例明显低于其他两种亚型(图4D)，此外，耗竭的CD8+ T细胞群(CD8- c1)在basal亚型中显著富集(图4E)。TCGA-BLCA和UTUC组织队列的单细胞去卷积分析也发现高比例耗竭CD8+ T细胞的与UCB和UTUC患者较差的生存显著相关(图4F)。

图4 basal亚型中耗竭T细胞的扩张

在这一部分作者研究了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）有关的细胞间相互作用。研究发现巨噬细胞与上皮细胞的互作频率高于其他髓系细胞，尤其是在basal亚型中(图5A)，在这两种细胞类型之间，研究也发现了强烈的由MIF和CD74介导的信号(图5B)。此外，basal UTUC表现出较高的CD47-SIRPA和C3-C3AR1相互作用(图5B)。因此，作者筛选了受体-配体对，发现CD8+ T细胞丰度、耗竭和巨噬细胞CXCL表达之间显著正相关(图5C)。

此外，在basal 亚型中，作者发现由CXCL及其受体介导的巨噬细胞与CD8+ T细胞相互作用更强(图5B)。这种关联在TCGA-BLCA和另一个UTUC队列中得到了进一步验证，且多重免疫荧光染色也显示，basal 亚型中表达CD68的巨噬细胞和表达CD8的CD8+ T细胞共定位(图5D)。接下来，研究观察到耗竭的CD8+ T细胞群CD8- c1与巨噬细胞表现出强烈的信号传导(图5E)，尤其是与Macro-C3(图5F)。Macro-C3和CD8- c1的比例也一致正相关(图5G)。

通过分析UTUC组织测序队列也进一步验证了这种相关性，其中耗竭评分和Macro-C3特征评分也显示出很强的相关性(图5H)。总的来说，这些证据揭示了UTUC中髓系和淋巴细胞组分之间强烈的相互作用，并表明上皮细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞共同形成了basal亚型的免疫抑制微环境(图5I)。

图5 TAMs诱导的CD8+T细胞的募集和耗竭决定了basal UTUC的生态系统

在文章的最后一部分，作者探索了亚型特异性免疫表型是否可以预测治疗反应。因此对一个阿特珠单抗治疗的转移性尿路上皮癌(mUC)的队列进行了分析。研究将患者肿瘤分为NMI亚型、lumina和basal亚型。在mUC数据集中，观察到basal肿瘤(38%)比lumina肿瘤(20%)或NMI(11%)肿瘤比例更高，且表现出炎症表型(图6A)。免疫组化染色进一步证实了basal亚型的炎症表型(图6B)。

进一步分析发现PD-L1在免疫细胞上的表达与basal亚型无关(图6C)。接下来，作者发现了CD274-PDCD1, CD86-CTLA4和LGALS9-HAVCR2等多种已知的相互作用与T细胞耗竭的正相关(图6D)。此外，作者也发现免疫抑制的Macro-C3特征基因和T细胞毒性基因的表达随着basal特征增强而增加(图6E)。因此，作者开发了一种计算方法，使用Macro-C3评分建模免疫逃逸程度，使用T细胞毒性评分建模细胞毒性T细胞(图6F)。

结果发现Macro-C3评分与PD-L1阻断治疗应答者比例显著相关。因此，作者将Macro-C3标记定义为ICI响应评分(图6G)。为了评估ICI反应的预测性能，作者将ICI反应评分与Macro-C3评分以及预测免疫检查点抑制的临床反应的已发表特征(TIDE)评分进行了比较。结果ROC曲线展示ICI反应评分的性能优于TIDE评分(图6H)。

图6 Macro-C3评分预测mUC的免疫治疗反应

到这里这篇文章的主要内容就介绍完了。研究使用单细胞数据，对UC进行了分型，并对不同亚型的肿瘤微环境组分及互作等进行了分析，并研究了与临床结局及免疫应答的关联。文章内容丰富，但是分析方法并不难，是一篇具有参考意义的单细胞分型分析文章，感兴趣的小伙伴不要错过呀。