【方法优化】食品中酸性橙II前处理优化思路

非食用着色剂酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引号：C.I. 15510，是一种常用的工业染料，有强致癌性。因其色泽鲜艳、匀染性好、价格低廉等特点，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生产加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用着色剂的检测范围。目前，国家已经发布3个推荐性的食品中酸性橙Ⅱ专用检测标准，但由于不同实验室间仪器、人员、实验耗材、样品等条件存在差异，完全执行方法就能达到回收率、精密度要求的情况很少。因此，根据实际情况进行方法的优化是必要的。

最近，小编在用不同的基质按照标准《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》做酸性橙Ⅱ回收实验时，发现回收率不很理想，而且6.1.2所规定的固态样品前处理方法非常耗时（特别是净化前提取液需“浓缩约至10mL”这一步）。因此小编依据标准方法对不同实验环节进行了一些优化，在这里将全过程分享给各位朋友以供参考交流~

样品净化步骤优化涉及SPE小柱与滤膜的选择、固相萃取操作步骤。

首先，我们需要按标准方法进行实验，验证所用SPE小柱与滤膜是否满足当下实验条件需求：

1. 根据标准3.6节（见下图）选择对应的SPE小柱。

由此，小编选择了月旭Welchrom® NH2小柱（500mg/6ml,30pk，货号：00509-11006）。

2. 使用酸性橙Ⅱ标准溶液，按标准6.1.3节的净化方法（见下图）进行固相萃取操作（小柱的活化方法见3.6），留取每一操作步骤的样液用于上机检测。

在这里，小编移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ标准溶液，加10mL水混匀作为上样溶液,并根据6.1.3分别收集上样液、淋洗液、洗脱液、二次洗脱液进行上机检测（此方法又称“分步留样”，是分析SPE操作过程中影响回收率的环节及原因的常用方法）。

3. 选择合适的滤膜过滤样液，上机检测。

根据6.1.3，样液上机前要过膜净化。我们都知道，滤膜作用是净化样液，防止杂质污染色谱柱。但使用滤膜（或使用不合适的滤膜）可能会影响目标物的回收率甚至引入杂峰。因此，小编尝试了三种过膜方式：1) 不过膜；2) 水系滤膜；3) Nylon滤膜。

蓝色为样液不过膜，峰面积12.0191

粉色为样液过水系滤膜，峰面积11.4695

黑色为样液过Nylon滤膜，峰面积6.4975

结果发现过膜后，过膜样液的图谱峰面积：过Nylon滤膜＜过水系滤膜＜不过膜，说明过水系膜或有机系膜都对目标物造成一定损失。因此后续实验的样液均不过膜上机。建议本实验样液上机前不过膜。

最后，小编发现上样液、淋洗液以及两次的洗脱液中都没有目标物酸性橙Ⅱ检出，酸性橙Ⅱ最终的回收率已经达到了95%-105%，满足了检测的要求。

其次，按照标准方法小编进行了空白基质加标实验，验证样品提取步骤是否影响不同基质样品中目标物的回收。实验方法如下图所示。

实验过程中，小编发现：

6.1.2 固态试样提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液（配制方法见3.4）提取2遍，再合并提取液，浓缩至10mL。

此时洗脱液总量约40mL，需40℃浓缩至10mL左右【相当于除去乙醇】。整个浓缩过程非常耗时，差不多处理一个样要一小时，而且最终的结果回收率非常不理想。

按照第一次实验的结果，小编进行了一些优化，标准上是全部提取液浓缩至10mL左右后净化，改为移取了其中20mL经浓缩至约5mL后上样。

根据第二次实验结果，回收率已经达到了90%-100%，满足了检测的要求。

称取样品2g（±0.01g）于50mL离心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超声提取30min，离心10min（4000r/min），吸取上清液于另一50mL离心管中；残渣中加入20mL乙醇-氨溶液，重复提取一次，合并两次上清液，混匀，准确移取20mL上清液，40℃旋转蒸发至少于5mL,转移至15mL离心管中，用水定容至10mL，待净化。

SPE柱：月旭Welchrom® NH2规格：500 mg/6mL

活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液过柱，弃去流出液

上样：将待净化液全部上样，自然流干，弃去流出液

淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，弃去流出液

洗脱：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集于15mL试管中，抽干小柱

浓缩：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC检测。

色谱柱：月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm

流动相：乙酸铵：甲醇=35:65

柱温：35℃

进样量：20μL
检测波长：484nm

流速：1.0mL/min

在优化标准方法的时候：

1）先选择合适的SPE小柱，用目标物标准溶液进行固相萃取操作，分步排查SPE步骤，确认小柱与标准方法是否满足具体要求；

2）再按标准方法，做空白基质加标，确认前处理样品提取步骤中目标物的损失情况，分析造成目标物损失的原因及步骤，有针对性优化方法；

3）接着做样品和样加标，看目标物回收率情况，优化提取量或提取次数；最后得出一个稳定的方法，保证满足标准回收率要求进行检测。