How to Analyze Biosimilars with Confidence

2022-11-15 13:40:41, ProteinMetrics

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大分子仿制药的开发：前景与挑战

由于复杂分子为治疗疾病提供了独特的优势，生物治疗药物的开发得到了极大的发展。随着许多新药的专利到期，开发更便宜的大分子仿制药具有巨大的前景。然而，与小分子仿制药不同的是，要满足此类复杂药物产品的监管标准会困难得多。

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大分子仿制药开发的技术障碍

监管机构要求大分子仿制药必须与原研药“高度相似”并且没有“临床意义差异”。但是生物系统是非常复杂的，表达系统可以极大地影响蛋白质的结构和功能。在开始临床前试验和临床PK/PD研究之前，EMA和FDA的法规需要全面的结构和功能分析数据来证明和确认足够的可比性。如果没有先进的分析软件，大分子仿制药开发的前景仍是未知的。

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高级软件提供广泛的可比数据

大分子仿制药开发需要卓越的分析能力来证明所需的高级别的相似性和可比性。如果可以提供详细分析数据的高级软件平台，那么都可以大大加快大分子仿制药的开发。在本技术简报中，我们提供了三个不同的示例说明创建一个成功的工作流程可以让研究人员能够快速、自信地进行数据比较。

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英夫利昔单抗仿制药和原研药的工作流

在这里，我们提出了一种方法，该方法不仅可以处理来自肽图的复杂数据，还可以处理完整的分子量分析，正交验证来识别主要异构体。为了扩展这种信息流以实现一致的分析流程，需要一个连贯的平台，如下所示的 Byos™。可以实现跨样本比较，并生成总结翻译后修饰 (PTM)、肽水平变体以及完整蛋白质序列细节的报告。

在本研究中，通过变体列表、翻译后修饰(PTMs) 和完整分子量的相比，商业批次的原研 mAb 和仿制 mAb 显示出相当大的相似性。这种比较还揭示了样品之间的一些分析差异。我们能够有效地突出 HC CDR2 区域脱酰胺、相对糖基化、C 末端赖氨酸截断和聚糖谱的相对α-岩藻糖基化的差异。

您可以在一个视图中清晰地看到肽图数据分析和报告的多个格式。

► 观察不同

数据分析和报告让您更方便的观察差异。

糖基化

Relative a-fucyosylation. Remicade 18+2% vs Remsima 10+2%.

脱酰胺

Deamidation within HC CDR2 at ASN 57. Remicade 1.9+0.15vs Remsima 2.7+0.1%.

糖化

Remsima的糖化比 Remicade 更丰富（糖化基于胰蛋白酶消化的缺失切割确定）。

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使用多种分析方法进行表征和比较

在这项研究中，我们使用多种分析方法证明了Neupogen的仿制药与其参考 Neupogen® 的物理化学相似性。使用了6个批次进行分析。

Byos 平台的先进功能允许进行多种比较：LC-M/MS 肽图分析和翻译后修饰（PTMs）、完整分子量可比性、高级结构和原始谱图的研究。各种严谨的方法表明，Neupogen 及其仿制药的一级序列具有 100% 的覆盖率，并且在理化性质方面高度相似。

仿制药和Neupogen的序列覆盖图：100%覆盖和相同的一级氨基酸序列。

在仿制药和 Neupogen 中检测到的氧化和脱酰胺百分比。

Neupogen 和其仿制药的完整 MS 原始谱和去卷积谱。

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使用非变性质谱(Native MS)和

简约电荷去卷积进行抗体分析

完整分子量分析可同时查看蛋白质混合物中的蛋白质形式，包括蛋白质治疗制剂，如单克隆抗体 (mAb)。变性条件产生更少的加合物、更高的电荷状态和更强的整体信号。天然条件保留了非共价结合和原始折叠结构，从而产生更少和更低的电荷状态。

数据采集后，m/z 谱去卷积为中性质谱。这个计算步骤容易出现错误和伪影，特别是对于来自异质混合物的复杂信号。在过去的 25 年中，几乎所有的电荷去卷积都是使用 MaxEnt 和 ReSpect™ 算法完成的。在这里，我们展示了非变性质谱和我们新的电荷去卷积算法在分析治疗性蛋白质中的实用性。

Protein Metrics Intact Mass™ 软件可以对宽 m/z 和 m 范围进行解卷积，且伪影极少。彩色点将质量与 m/z 峰连接起来，便于视觉验证。可选的峰值锐化提供超分辨率。可以根据计算的质量或质量增量手动或自动进行分配。

英夫利昔单抗是一种用于治疗自身免疫性疾病的抗 TNF-α mAb。对去糖基化英夫利昔单抗的高分辨率非变性质谱分析揭示了三种强度大致相同的蛋白型，相差 128 Da。红色、蓝色和橙色圆点显示带有 G0F(2) 的 mAb；每个峰都以 162 Da 间距开始一系列峰。

据我们所知，西妥昔单抗（一种EGFR抑制剂）是市场上唯一具有Fab糖基化的单抗。在HC CDR2和CDR3之间的Fab位点包括许多通常在Fc位点上没有发现的糖型Janin-Bussat et al. In Glycosylation Engineering of Biopharmaceuticals: Methods and Protocols; Beck, A., Ed.; Humana Press, 2013)。去卷积谱的缩放显示了Fc上的普通单抗糖基化，但在HC可变区（Fd）上更复杂的n-聚糖，包括Gal-α-Gal、岩藻糖基化和多岩藻糖基化。

达利珠单抗是一种用于治疗多发性硬化症的抗 CD25 单抗。对去糖基化 Daclizumab 样品进行高分辨率非变性质谱分析显示 N 末端延伸和截断。

Obinutuzimab是一种抗CD20 单抗，用于治疗白血病和淋巴瘤；它具有糖工程化的 Fc 部分（减少的核心岩藻糖基化导致更高的 FcγRIIIa 和 FcγRIIIb 亲和力）以增强其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)。Orbitrap Exactive EMR 上的native MS 可以很好地分离电荷状态和高 m/z 分辨率（受限于同位素扩散，而不是仪器分辨率）。

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总结

加速大分子仿制药的开发需要先进的软件平台来简化分析并提供对多个关键质量属性的详细分析。Byos 允许研究人员定义包括处理参数和报告模板在内的工作流，然后由组织中的任何级别的其他研究员统一执行。因此，通过这种可自定义、分析参数保持一致的方法，快速、系统地研究一种新的大分子仿制药，从而改进大分子仿制药的开发。

► References

ASMS2018: Enabling a Multi-Attribute Method Comparison of Infliximab®

ASMS2017: Analytical Characterization and Comparison of Filgrastim and Its Biosimilar ASMS2018: Antibody Analysis with Native Mass Spectrometry and Parsimonious Charge Deconvoution

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