自动监测 iPSC 衍生的 3D 脑类器官的发育和活动分析

人类的大脑非常复杂，这使得它在体外和模式生物上的研究都非常有挑战性。培养的神经元不能充分体现三维（3D） 体系结构、复杂性和大脑的微环境。类器官的使用帮助定义了一些保守元素的发育通路，模型适合研究诸如年龄相关的神经退行性疾病。

当然，使用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的脑类器官是一个有前途的模型，它概括了人类神经发育的各个方面，自我组织成离散的大脑区域，以及它们的基因表达模式与体内数据相似。过往的努力加速了几种培养大脑类器官的方案和技术的发展，这些方案和技术使大脑发育和与之相关的疾病的研究成为可能 - 最值得注意的是，培养大脑类器官的能力允许研究人体皮质发育及其相关疾病。在脑类器官可以大规模用于功能基因组学研究，药物发现和研究化合物诱导的毒性作用之前还有很多工作要做。

这里我们描述了一种半自动培养和监测脑类器官的方法，以及通过记录 Ca2⁺ 振荡来测试功能性神经元活性。脑类器官是使用以前发表的方法由 iPSC 开发而来。我们的方法适用于部分自动化的工作流程，培养监测使用 ImageXpress Micro 共聚焦高内涵成像系统。我们在透射光下连续监测开发的脑微组织的大小和形态超过 20 周的发育。基于深度学习的 IN Carta 图像分析软件被用于量化组织的大小和形状。被选中的微组织会用共聚焦成像在发育的不同的阶段分析 Sox2，TuJ1，和 GAFP 标记物的表达。用成像系统记录被选中的微组织功能活性，钙振荡。在培养的 50 天以后观察到钙震荡，零星存在在微组织中。

同时仍有很多针对脑类器官培养和扩展性的领域需要被优化，这里我们展示了基于深度学习的图像分析用于监测和钙成像作为功能性读数。

人源 iPSC 细胞（SC102A-1，System Biosciences） 解冻并培养在基质胶包被的完全添加 mTeSR Plus 的培养基（STEMCELL Technologies）中。培养基每天更换一次，但每周会有一天加双倍培养基，此时隔天更换培养基。每 4 - 5 天使用无酶试剂 ReLeSR （STEMCELL Technologies）以 1:6 – 1:10 的比例传代细胞。

所有用于脑类器官发育的试剂都来源于 STEMdiff Cerebral Organoid Kit（STEMCELL Technologies #08570）。该试剂盒针对脑类器官形成已经在 Lancaster 基础上优化。简言之，iPSC 细胞以 9000 细胞 / 孔接种在低吸附 96 孔 板（Corning）的胚体 （EB）内，EB 形成培养基替代普通培养基。在第 5 天，对 EBs 进行成像以确保他们准备好进行神经诱导。EBs 被转移到包含诱导培养基的 24 孔板。在第 7 天，EBs 被转移到基质胶（Corning）液滴中。含有成熟培养基的 6 孔板每孔转移大约 6 - 8 滴。含有类器官的微孔板放置在 37℃ 震荡培养箱中发育成熟，每 3 - 4 天更换新的培养基。

钙流按照 FLIPR Calcium 6 Assay Kit（Molecular Devices）厂家说明书操作。从第 17 天开始，一个染色 2 小时的类器官加入并使用 ImageXpress Micro Confocal 成像。

整个类器官被 4% PFA，4℃，过夜固定，随后用 PBS 快速清洗。用 0.5% triton-X 的 PBS 透化。类器官用以下抗体孵育并染色 48 小时：Hoechst（33 µM，Invitrogen cat. #33342），Alexa Fluor 555 mouse anti-ß-tubulin（1:100，Becton Dickinson cat. #560339），Alexa Fluor 647 mouse anti-Sox2 （1:100，Becton Dickinson cat. #562139），Alexa Fluor Plus 750 Phalloidin（ThermoFisher Scientific cat. #A30105）.

所有图像均使用 ImageXpress Micro Confocal 成像系统（Molecular Devices）的 MetaXpress 高内涵图像获取和分析软件。IN Carta 图像分析软件被用于所有的分析。IN Carta 的 SINAP 模块被用于所有图像的分割。每个模型都经过训练并在用于分析方案之前进行验证。对于钙离子成像，拍照时 camera binning 设置为 2，为了提高成像速度，使用 50 um 狭缝共聚焦转盘。

根据 Lancaster 等人改编的方案培养大脑类器官，在此方法中，类器官生长在培养基中，促自组织和模式化。胚状体是在细胞外基质（基质胶）中进一步分化以改善神经上皮的极化以及支持大神经上皮芽的生长。这些芽从 EB 延伸出来，包含类似于脑室的空腔。图 1 说明了用于生成 iPSC 衍生的脑类器官的主要步骤。

图 1 使用内在模式化方法生成的 iPSC 衍生的脑类器官。

iPSC 细胞被用于生成 EBs。A) 用于生成 iPSC 衍生的脑类器官的主要步骤。使用的方案基于 Lancaster & Knoblich，2014 年使用 STEMCELL Technologies 的培养基。

B) 到第 5 天，大多数 EB 的直径至少为 400 μm。EB 显示平滑的轮廓，表面附近的区域在光学上更亮 （在显微镜明场中）。板预览图中选取示例放大在右侧，比例尺 =100 µm。

C) EB 被转移到添加神经诱导培养基后的图像，光学上半透明边缘提示神经上皮的形成。比例尺 = 100 μm。

D) 从第 8 天到第 10 天，类器官被嵌入基质胶中，支持神经上皮质的扩张。注意许多上皮芽的形成。

E) 类器官被转移到振荡培养箱并发育成熟。数字相机在成熟过程中对大脑类器官进行了成像。

F) 类器官被固定并用 Hoechst（核，蓝色），TUJ1 （神经元，绿色），SOX2（径向神经胶质细胞 ，红色 ）染色。图像上的暗线是图像平铺的结果。

为了监控类器官发育的情况，我们使用基于 AI 的分割工具去分析明场图像。EBs 以及类器官的生长可以通过检测他们随时间变化的直径体现。使用基于深度学习的方法识别 EB 的优点之一包括更强大的分割。该模型经过训练，可排除大多数碎屑、灰尘颗粒和成像伪影。

要确定构成类器官的细胞类型，将选定的类器官固定并用 Hoechst（核 ，蓝色），TUJ1（神经元，绿色 ），SOX2（径向神经胶质细胞，红色）在多个时间点进行染色。脑类器官显示的组织让人联想到正在发育的大脑。在类器官的心室周围发现了桡神经胶质细胞。较老的类器官（第 8 周）与不太成熟的类器官（第 4 周）相比，脑室更大但更少。( 图 3 )。

图 2 使用基于深度学习的分割（SINAP）分析明场图像。

A) 在进行神经诱导步骤之前，对 EB 的大小进行监测。图中显示了使用 IN Carta 中的 SINAP 工具的图像及其相应的分割蒙版 （品红色）的示例。

B) 直方图显示 EB 直径的分布。分档尺寸 = 10 μm。

C) 可以使用明场成像监测类器官的成熟度，并且使用 IN Carta SINAP 工具进行分析。训练自定义深度学习模型，然后将其应用于数据集。图中显示了带有分割蒙版（洋红色）的类器官示例。请注意， SINAP 模型允许分割具有不同形状和大小的类器官。比例尺 = 100 μm。

图 3 脑类器官显示的组织让人联想到正在发育的大脑。

钙成像后，类器官被固定并用 Hoechst（核，蓝色），SOX2（径向神经胶质细胞，红色）染色。这里显示的是一个光学部分。心室（框内）可在 4 周和 8 周龄的类器官中观察到。SOX2 染色表明桡动脉神经胶质细胞位于心室附近，其模式类似于发育中的皮质层中的细胞组织。比例尺 = 100 μm。

钙成像可用作功能测定确定神经元活动。4 从第 4 周开始，我们观察到加入 FLIPR Calcium 6 染料的脑类器官中的钙活性。（图 4）钙的活动频率低，表明当时类器官中的神经元仍然不成熟。到第 13 周，钙活性似乎更同步，提示神经元在功能网络中相互连接（ 图 5 ）。

为了探索在毒性研究中使用这些脑类器官的可行性，将类器官与 4-Aminopyridine（神经兴奋剂）和 muscimol（神经抑制剂）等化合物一起孵育。在某些情况下，4-AP 指示钙活性的激活（图 6）。

图 4 钙活性早在第四周就出现了。

A) 类器官中加入 FLIPR Calcium 6 染料，钙流活性通过 ImageXpress Micro Confocal system 监测。

B) 钙强度随时间的变化图，如右图所示。黄色迹线对应于箭头在 （C）中。紫色轨迹表示相邻区域。

C) 从（A）拍摄的框内区域的特写视图。沿虚线的强度分布图显示在图底。箭头对应于强度文件中的星号峰值。

图 5 第 13 周钙活性同步。

A) 图像显示了加入 Calcium 6 染料的类器官的光学部分。

B) 来自方框区域的钙强度表示为随时间推移的平均强度。

C) 从（A）显示的框区域的特写视图随时间变化。箭头表示强度升高。底部图像将钙强度表示为热图。注意从初始尖峰扩散的强度，表明存在神经元网络。

图 6 由神经兴奋剂引发的钙活性。

A) 将类器官与 100 nM 的 4-AP 一起孵育 30 分钟，然后成像。观察到大量钙信号出现。方框区域表示观察到钙峰值的区域。它们相应的强度分布如下所示。

B) 用 muscimol 处理的类器官。这里显示的是去除 muscimol 后钙活性恢复的一个例子。由于类器官的瞬态 / 非一致活性，GABA 的抑制作用尚无定论。钙信号传导事件及其强度分布显示在方框区域中。