项目文章Cell Rep |中国医科院刘芝华教授团队利用三组学联合分析揭示OTUB2/STAT1/CALML3/PS轴的抑癌机制

鳞状细胞癌小鼠模型、OTUB2敲除鳞状细胞癌小鼠模型、人鳞状细胞癌细胞系

为了研究OTUB2在上消化道鳞状细胞癌中的功能，作者首先检测了其在正常食管上皮及食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中的表达情况，相较于ESCC组织，OTUB2在正常食管上皮中高表达，且预后分析表明OTUB2高表达的食管鳞状细胞癌患者预后更好。于是，作者构建了一个OTUB2敲除ESCC小鼠模型，OTUB2敲除ESCC小鼠中发生舌瘤结节数量及ESCC发生率明显高于野生型ESCC小鼠。接下来，作者将OTUB2敲除的上皮细胞系异种移植到小鼠体内，观察OTUB2敲除是否可以促进人鳞状细胞癌的发生，结果发现，OTUB2沉默的上皮细胞表现出较强的致癌能力，进一步验证了OTUB2在上消化道鳞状细胞癌发生中的抑癌作用。

作者通过转录组和蛋白质组学联合分析，探讨OTUB2肿瘤抑制机制。联合分析显示11个基因的mRNA水平和蛋白水平表现出一致的上调或下调，其中，CALML3被选择进行进一步研究，因为据报道它在口腔和皮肤鳞状细胞癌中下调，并作为区分肺鳞状细胞癌和肺腺癌的重要标志物。在SCC细胞中过表达OTUB2后肿瘤的生长受到抑制，且过表达OTUB2后CALML3 mRNA和蛋白水平持续升高，而CALML3敲低消除了OTUB2对肿瘤发生的抑制。这些结果证实了CALML3是介导OTUB2肿瘤抑制功能的关键下游效应因子。

为了确定OTUB2/CALML3抑制肿瘤作用的下游事件，对转录组和蛋白质组数据进行了KEGG富集分析，发现几种脂质代谢途径显著富集。于是作者对小鼠肿瘤组织进行脂质组学分析，在OTUB2和CALML3表达组中甘油磷脂显著增加，其中磷脂酰丝氨酸（PS）最为显著，提示这可能是介导OTUB2抑癌功能的关键代谢事件。

钙调素是一种多功能的Ca²⁺感应蛋白，通过调节靶蛋白来控制各种细胞事件。CALML3与钙调素有85%的同源性，作者预测CALML3与钙调素一样，可通过感应Ca²⁺水平调节离子通道。研究发现，过表达OTUB2或CALML3显著增加了细胞内Ca²⁺的浓度，用Ca²⁺通道抑制剂处理细胞后，完全消除了OTUB2或CALML3过表达引发的PS合成升高，证明OTUB2/CALML3轴通过控制细胞内Ca²⁺水平来调节PS的合成。

OTUB2通过激活CALML3来抑制SCC，然而，OTUB2本身的蛋白结构没有作为转录因子的特点，因此作者进一步通过质谱鉴定，锁定了STAT1是介导OTUB2对CALML3转录激活的关键转录因子。

泛素化实验证实STAT1是去泛素化酶OTUB2的直接底物，且OTUB2对STAT1的去泛素化修饰在不影响其蛋白稳定性的情况下促进了STAT1的Tyr701位点磷酸化修饰及进一步的二聚体形成。这些结果揭示了去泛素化修饰、磷酸化对转录因子STAT1活性的调控，随后增强CALML3的转录激活。

PS是细胞膜的功能成分，是神经系统的重要组成部分。PS在肉、脑组织、大豆和其他内脏器官中含量丰富。外源性PS可以跨越血脑屏障，并已被证明可以改善记忆力、注意力和学习能力。PS已被批准为世界范围内的食品补充剂，健康补充剂。然而，补充PS是否发挥抗癌作用仍不清楚。为了进一步验证口服PS对上消化道鳞状细胞癌的抑制功能，作者利用鳞状细胞癌人源肿瘤组织异种移植模型进行了临床前研究，并发现口服PS显著抑制了OTUB2低表达鳞状细胞癌的发生以及增强了其对化疗药物的敏感性。这些数据证明了口服PS的靶向作用，为后续进一步探索应用PS预防及治疗人类恶性肿瘤提供了重要的前期基础。