客户文章 | 多组学分析揭示肝内胆管癌的分子亚群和潜在的治疗靶点

实验样本

原发肿瘤组织和血液样本，采集于2014年至2021年。肿瘤组织经福尔马林固定石蜡包埋，血样保存于液氮中，包括ICC 患者训练队列（N=110）和独立验证队列（N=41）。

实验设计

实验工作流程见图1A；

实验方法：TMTpro 16plex, 分60个Fraction, 合并成30 Fraction上机。

文章结果

为全面表征 ICC 肿瘤的分子特征，研究人员对来自110名患者的ICC组织进行了蛋白质组学分析，总共鉴定和定量了 10,888种蛋白质，其中在缺失值少于 10% 的样品中检测到了6,311 种蛋白质。

研究将ICC队列分成了三个不同的簇（C1、C2 和 C3），三种分子亚型之间的所有比较共鉴定了85种DEPs（图1C）。其中，32 种蛋白质在亚型1中上调，24 种蛋白质在亚型2中上调，29种蛋白质在亚型3中上调。根据GO分析的结果，研究人员将三种分子亚型注释为“慢性炎症”（亚型1）、“代谢”（亚型2）和“染色质重塑”（亚型3；图1B和C）。使用相关基因组对蛋白质组数据进行基因集合富集分析（GSEA）表明，与其他两种亚型相比，慢性炎症亚型的炎症反应评分最高（图1D)。

根据三种亚型对ICC患者进行分层后，研究人员发现不同ICC亚型患者的生存期存在显著差异（图1H）。慢性炎症亚型组的患者生存时间最短，而染色质重塑亚型患者生存时间最长。Kaplan-Meier对总生存期 (OS) 的评估表明，独立验证ICC队列中慢性炎症亚型患者的预后最差。总之，通过蛋白质组学分析能够将ICC分为具有不同分子特征和患者生存期的组。

为进一步探索三种分子亚型的基因组特征，研究人员在训练队列中使用人类ICC 肿瘤进行WES，描绘了78个样本的基因组图谱（图2A）。

研究人员使用基于随机森林的机器学习方法来识别每个分子亚型中的关键基因突变。研究发现在慢性炎症和代谢亚型中都有KMT2D突变。在所有已确定的突变中，只有KMT2D中的突变与ICC患者的更好预后显著相关（图2F）。MSK泛癌基因组数据证实，与野生型KMT2D的患者（KMT2D^wt）相比，具有KMT2D突变（KMT2D^mut）的患者预后更好。在代谢亚型中也发现了显著高比例的KMT2D^mut（卡方检验 P < 0.01；图 2G）。与KMT2D^wt 组织相比，KMT2D^mut 组织具有更高的代谢ssGSEA评分和更低的炎症ssGSEA评分（图2H 和I）。总之，研究人员确定 KMT2D^mut 与 ICC的慢性炎症和代谢亚型相关。

研究人员使用ssGSEA方法通过评估蛋白质组数据中每种细胞类型的基因特征来估计21个免疫细胞群的丰度（图3A）。在慢性炎症亚型中发现巨噬细胞显著增多（图 3B）。IHC染色结果表明，在具有慢性炎症亚型的样本中发现的巨噬细胞比在其他两种亚型中多（图3C和D）。

为了进一步表征慢性炎症亚型的免疫特征，研究人员对慢性炎症亚型组的肿瘤组织进行了scRNA-seq研究。ICC肿瘤微环境（TME）中共鉴定出恶性细胞、成纤维细胞、内皮细胞和各种免疫细胞等10种细胞类型（图4A），之后确定了每种细胞类型中的特征基因。慢性炎症TME中的TAM被发现是三种亚型之间的主要区别。巨噬细胞进一步分为两个簇：1型和2型（图4B）。几种M2巨噬细胞标志物（IL10、IL1B、HLADRA 和 CD163）在1型和2型中均有表达。M2和M1的 ssGSEA 评分在2型巨噬细胞中均高于1型巨噬细胞，这表明ICC中巨噬细胞的传统M1/M2分类可能不适用。 

接下来，研究人员使用GSVA方法计算两种亚型的TAM炎症反应评分。2型TAM 的炎症反应评分显著高于1型TAM（图4C和D）。TAM的两个亚组之间的差异表达基因 (DEG) 分析表明，APOE、LIPA、CTSD、C1QB 和其他几个基因在2型TAM中显著上调（图4E）。这些上调基因的GO分析发现，炎症反应的正调节和免疫系统的负调节富集，表明2型巨噬细胞可能参与调节 ICC 的炎症反应（图4F）。APOE 和 C1QB 在2型 TAM 中的共表达通过APOE/CD68和 C1QB/CD68 得以验证（图4G-I）。在慢性炎症亚型中发现的 APOE⁺C1QB⁺TAM 数量高于其他两种亚型（图4J和K）。与具有KMT2D^mut的组织相比，KMT2D^wt的组织具有更多数量的APOE⁺C1QB⁺TAM（图4L和M）。Kaplan-Meier曲线和单变量 Cox回归分析表明，APOE和C1QB高表达患者的OS显著低于低表达组患者。

研究人员用来自1型和2型TAM比较的前20个上调的2型TAM DEG定义2型 APOE⁺C1QB⁺TAM特征，并根据训练队列中的蛋白质组数据进行了ssGSEA。慢性炎症亚型的APOE⁺C1QB⁺TAM评分最高（图4N），表明2型APOE⁺C1QB⁺TAM是ICC慢性炎症亚型的主要决定因素。KMT2D^WT患者的2型APOE⁺C1QB⁺TAM评分高于KMT2D^mut患者（图4O），2型 APOE⁺C1QB⁺TAM评分高的患者的OS显著低于评分低的患者。

为研究KMT2D突变如何重塑ICC TME中的TAM，研究人员筛选了一系列人ICC细胞系，发现KMT2D在CCLP1细胞中高表达，而在HCCC9810细胞中低表达（图5A）。随后，研究人员发现APOE⁺C1QB⁺TAM通过产生TNFα的 CD4⁺T细胞促进ICC TME中的炎症反应。

研究人员在小鼠 ICC 肿瘤模型中注入CSF1R 抗体以消耗 TAM（图 6A），结果发现，CSF1R 抗体处理组的肿瘤负荷显著降低（图6B和C）。Ki67染色表明 CSF1R 抗体处理组的增殖低于对照组（图6E）。IF染色显示CSF1R抗体处理组中 APOE⁺C1QB⁺TAM的数量低于对照组（图 6F和G）。此外，在CSF1R 抗体处理组中发现的APOE⁺C1QB⁺TAM比例在所有 F4/80⁺细胞中低于对照组（图6H）。在 CSF1R 抗体处理后，APOE⁺C1QB⁺TAM 被耗尽，并观察到较少的T细胞炎症，这可通过TNF 信号所量化（图6I和J）。这些结果表明，APOE⁺C1QB⁺TAM可能是针对 ICC 的免疫治疗的潜在靶点。