ASMS 2022 | 聚焦基于质谱的蛋白质组学

Speaker: Florian Harking

近年来，基于质谱的蛋白质组学越来越受欢迎，人们关注的焦点是开发更短的液相梯度、更高分辨率/更快扫描速度的质谱仪，这使得检测大量样本队列成为可能。随着测量样本数量的增加，建立快速、可重复的自动化蛋白质组学样品制备工作流程的需求越来越大。

本报告中，作者们提出了一个全自动端到端蛋白质组学样品制备流程。从Hela细胞裂解液到消化成多肽，可在2小时内完成，磷酸化富集则需要在此基础上增加2小时。整个工作流程是在Opentrons-2机器人与Evosep整合完成。研究者优化了方案的速度和操作简洁性，并专注于低含量的磷蛋白组，起始蛋白量小于200 μg。酶解时间缩短至1小时，在室温下进行，酶解解理效率约为70-80%，与隔夜酶解相当。在结合缓冲液中对样品进行酸化和直接稀释，就足以使用Ti-IMAC富集磷酸肽，富集效率超过90%，其间不需要任何C18清除。最终，48个样品的整个过程的总处理时间不到5小时。在初步实验中，使用21分钟梯度结合Exploris480系统下的DIA采集模式，可从20 μg的多肽样本中鉴定约4-5000个磷酸化多肽。

Speaker: Xinyan Wu

基于内分泌的治疗联合CDK 4/6抑制剂（palbociclib, ribociclib和abemaciclib）是转移性乳腺癌伴雌激素受体ER+的标准治疗方案。然而，几乎所有ER+的乳腺癌最终都会对CDK 4/6抑制剂产生获得性耐药。因此，识别CDK4/6抑制剂耐药的生物标志物，以及开发克服CDK4/6抑制剂耐药的新策略是至关重要。研究者建立了MCF7- palbociclib耐药细胞株，通过6plex TMT标记定量蛋白质组学方法分析比较了敏感株和耐药株的蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学表达差异。该研究鉴定了9,477个蛋白和7,348个蛋白的35,493个磷酸化位点。总蛋白质组数据进行了基因集富集分析（GSEA），揭示了干扰素信号和炎症反应通路在上调蛋白中富集最显著。western blot分析证实了许多关键信号分子，包括STAT1、EIF2AK2、ISG15、OAS2和IFIT3在MCF7-PalbR细胞中显著上调。敲除STAT1可以使MCF7-palbociclib耐药株对palbociclib重获敏感。磷酸化蛋白差异分析中发现，耐药细胞通路变化集中于细胞周期、DNA复制和有丝分裂等生物学过程。有趣的是，许多过度磷酸化的蛋白质参与了与病毒感染相关的信号通路。

Speaker: Peyton R Sayasith

电荷检测质谱（CDMS）是一种单粒子技术，能够同时测量离子的质荷比（m/z）和电荷。这允许在兆道尔顿到千兆道尔顿范围内精确测量不同量级的离子。离子迁移率谱（IMS）与质谱（MS）耦合，通过测量电荷的电迁移率（淌度）和碰撞横截面（CCS），为更小的生物分子提供额外的结构信息。然而，由于传统的质谱无法解卷积带大电荷的离子和多相离子，导致IMS-MS受到了限制。因此，IMS-CDMS仪器利用CDMS独立测量电荷的能力，将使CCS对大分子的测量远远超过传统的IMS-MS手段。u型淌度分析仪的亮点是，针对兆道尔顿的离子分辨率超过1,400。IMS- CDMS仪器选用u型淌度分析仪（UMA）作为IMS组件，该分析仪包含两个通道，每个通道由对抗高速气体流动的电场组成。利用SIMION和Ansys Fluent分别计算并导出电场和气体流动阵列。这些阵列然后被读入自定义的Fortran程序，该程序模拟离子轨迹。为IMS-CDMS设计的UMA中，离子的流动性范围很广，质量范围从1到数百兆道尔顿不等。然后，利用特定淌度可以传输的电场值范围来计算UMA的分辨率。

Speaker: Theodore Alexandrov

新兴的单细胞技术揭示了以前小于平均细胞数的细胞类型和状态。许许多多单细胞代谢组学的多种方法被提出。研究人员在这里开发了一种结合显微镜和MALDI成像质谱的空间单细胞代谢组学方法，被命名为SpaceM。 

SpaceM可以从1000个独立的细胞中检测到100种代谢物和脂质。SpaceM有助于预测细胞类型和研究细胞的代谢状态等，尤其是在纯和基因刺激肝细胞的脂肪肝疾病模型阶段中。尽管有这些发展和进步，单细胞代谢组学的吞吐量仍然很低，仅限于少数样本，实验可以涵盖50-100个样本，但需要多个批次处理和数周的时间。这阻碍了单细胞代谢组学在临床中的应用。

研究人员开发了高通量SpaceM的雏形，这是针对高通量空间单细胞代谢组学的SpaceM方法的优化，被命名为HT-SpaceM, 细胞可以培养在64孔玻片上，通过使用可移动的腔室来创建玻片上的孔位，这种方法与SpaceM样品制备、显微镜和maldi成像质谱兼容。

研究人员同时面对了如何将高通量实验、细胞制备、显微图像采集与MALDI成像采集兼容的挑战。该研究对高效处理图像分析、代谢物和脂质识别、以自动化方式处理几十个数据集，以及执行QC和数据分析提供了参考。

Speaker: Martin Frejno

基于质谱的蛋白质组学数据是通过数据依赖（DDA）、数据非依赖（DIA）或靶向检测（PRM）方法获得的。通常，前者使用spectrum-centric的算法分析，假设它生成的是非嵌合光谱图，而后两者以peptide-centric的方式分析。然而，以peptide-centric的方法往往难以计算多个肽段对实验产生的实际子离子强度的贡献。最近，研究人员发现DDA（也可以扩展到PRM）的光谱可以基本嵌合，并引入了一种不考虑isolation window大小的光谱去卷积的方法，从而大大增加了DDA的肽段鉴定量。在这里，研究人员证明了同样的方法可以推广到任何嵌合的二级质谱谱，统一了DDA、DIA和PRM数据的分析。

研究人员在最初的粗略搜索之后，执行数据驱动的模型优化，以最大限度地提高预测精度。在主搜索过程中，利用MS1特征对MS2谱进行无预处理和候选选择的分析。相反，在每个MS2的isolation windown中，所有候选多肽被同时考虑进去，并在一个一致的步骤中竞争参与实验产生的子离子强度。该算法旨在用尽可能少的候选多肽解释尽可能多的子离子强度，并将共享的子离子的强度分布到多肽图谱的匹配中，然后估计出它们对实验产生的MS2谱的贡献比例，从而实现对嵌合光谱的反卷积。