NanoTemper Monolith及Promethus助力小分子靶向无序蛋白(IDP)的研究

2022-11-03 10:20:35, NanoTemper 诺坦普科技(北京)有限公司




高 分 文 献 解 读


前列腺癌是全球男性最常见的癌症之一。早期、低级别的癌症可以通过手术或放射成功治疗。对于患有前列腺以外的高级别肿瘤的患者,标准治疗与雄激素治疗相结合。雄激素消融阻断前列腺肿瘤赖以生长和存活的男性激素,最初是有效的;然而,在没有雄激素的情况下,前列腺癌会再次生长,并发展为更具侵袭性的形式,称为去势抵抗型前列腺癌(CRPC)。抗去势前列腺癌患者不可避免地会对抗雄激素疗法产生耐药性,部分原因是雄激素受体(AR)突变或剪接变体能够恢复AR信号。


上海奕拓生物和上海中国科学院生物与化学交叉研究中心朱继东/朱光亚团队合作的研究显示配体活化的AR可以形成转录活性的聚合物。AR的结构化和非结构化区域都有助于AR的有效相分离,无序N端起主要作用。AR液-液相分离行为具有转录活性和抗雄激素功效。抗雄激素可以以配体独立的方式促进AR抗性突变体的相分离和转录活性。该研究进行了基于相分离的表型筛选,并鉴定了ET516分子,ET516特异性破坏AR聚合物,有效抑制AR转录活性,并抑制表达AR抗性突变体的前列腺癌细胞的增殖和肿瘤生长。研究的结果表明液-液相分离是一种新的耐药机制,并表明靶向相分离可能为药物发现提供一种可行的途径。


https://doi.org/10.1038/s41589-022-01151-y




在这项研究中,来自于NanoTemper的微量热泳动MST互作技术以及nanoDSF蛋白稳定性技术发挥了重要的作用。


图注:微量热泳动(MST)实验,作者用AR (NTD,1-555aa)–mEGFP


蛋白与不同浓度的ET516(蓝色)以及Enza(红色)孵育进行MST实验。mEGFP蛋白用作阴性对照(绿色)。使用亲和力分析软件拟合数据。结果表明,ET516与NTD的亲和力Kd值25µM,表明ET516可以作为很好的候选分子。


图注:与ET516孵育的AR AF-1(144-450 aa,0.3 mg/mL)中的TSA测定


加热过程从25℃增加到81.5℃,升温速率为1℃/min。记录发射强度比(Em350nm\\/Em330nm),分析荧光强度比(左图)和一阶导数(右图)。

 

监测蛋白内源荧光的nanoDSF实验显示,ET516处理后AR AF-1中的荧光比率呈剂量依赖性下降,进一步证实了ET516和AF-1的相互作用。热位移TSA结果表明,AF-1是典型的固有无序蛋白,其在加热过程中没有明显的发射强度变化;然而,与ET516孵育诱导了AF-1熔化温度的剂量依赖性变化,表现为球状蛋白,表明ET516与重新分布后稳定的构象AF-1结合。Promethus系列仪器通过内源荧光检测,无需加入染料,对缓冲液没有要求,高精准的检测精度可以保证即使是极小结构变化造成的Tm值shift都可以很好表征。

 

对于固有无序蛋白,因为其蛋白的无序性的特性,其他常规方法难以进行检测。在这篇工作中,通过MST技术及nanoDSF技术,很好的筛选到目的分子。


Monolith系列分子互作仪基于MST技术,不依赖于分子量的改变,蛋白用量少,对于蛋白聚集耐受度高,可以轻松表征不同类型的分子间相互作用

生物分子互作仪 Monolith X


Promethus系列仪器,以nanoDSF技术为核心,通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性,该技术检测蛋白浓度宽泛,低浓度也可轻松表征,媲美DSC的高精准检测结果,快速高通量的检测速度,在小分子筛选上具有不可比拟的优势。

蛋白稳定性分析仪 PR Panta




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