干货 | 基因功能研究之蛋白酶活催化实验

2022-10-31 22:56:23, 小维武汉迈特维尔生物科技有限公司

前面的推文中，我们简单介绍了基于转录组+代谢组的技术手段进行基因的挖掘和筛选后，下一步的工作是基因的功能研究。基因功能研究包括酶活，基因过表达，双荧光素酶实验，酵母单杂，染色质免疫共沉淀，EMSA等等。我们今天就来详细介绍下，什么是蛋白酶活催化实验技术，以及蛋白酶活催化实验技术在转录组+代谢组文章后期的应用。

蛋白酶活催化实验是什么？

通过正向遗传学或者反向遗传学获得某个基因后，一般会对基因进行体内体外的分子实验，来研究这个基因的功能。对于结构基因来说，除了体内的敲除或者过表达实验来确认功能之外，体外的蛋白酶活催化实验也是比较常用的一种方法，尤其是在催化中药活性物质的一些蛋白酶的验证，往往必不可少。以2020年发表在Nature上的Discovery and engineering of colchicine alkaloid biosynthesis”的研究论文为例，该研究通过转录组+代谢组的研究方法解析了嘉兰中秋水仙碱的通路结构基因，并通过蛋白酶活催化实验一步步确定秋水仙碱从从苯丙氨酸和酪氨酸开始合成秋水仙碱前体的生物合成途径，蛋白酶活催化实验通过体外方式，确定基因蛋白酶的催化功能。

为什么做蛋白酶活催化实验？

蛋白酶活催化实验，通过将待研究的候选基因转入载体，通过外源原核或者真核系统诱导基因表达蛋白，提取纯化后，构建含有该蛋白和底物的反应体系进行反应，以验证该候选基因的蛋白是否具有催化底物的作用。

蛋白酶活催化实验流程是什么？

1.候选基因的获得和基因分析

待研究的基因为具有特定功能的结构基因，针对某物中的特定基因，需要通过参考基因组或者其他数据库获得该基因的CDS序列及蛋白序列。基因蛋白序列进行blast比对，预测基因功能。选择BlastP结果显示前面几条（就是E-Value较小的几个）确认结构基因功能类型，以及蛋白结构域分析，确认该基因包含的结构域，预测基因的功能，总结酶活验证所需要的条件。

2.基因克隆和载体构建

针对我们研究的目的基因，我们需要克隆得到全长CDS序列，供后续蛋白表达以及酶活功能研究。利用PCR技术，从研究物种cDNA里面扩增出目的基因，然后测序确定序列，供后续实验。首先是针对基因设计特定引物。引物设计完成后，从研究样本中，通过提取RNA，反转录得到cDNA模板，通过PCR手段，增加样品中基因的拷贝数，让目的基因“富集”，从而进行下一步研究。PCR扩增完成，进行凝胶电泳，成像，切胶回收。

在蛋白原核表达的过程中，需要我们构件好表达所需的重组载体，转化至感受态细胞中，进而诱导表达得到目的蛋白，供后续实验。重组载体构建方法，目前发明了很多种，大致分为三类：①先对载体酶切线性化，后连接（传统酶切连法、一步法无缝克隆）②载体酶切和连接同时进行（Golden Gate）③同源重组方法（Gateway）

3.蛋白原核表达

一般将蛋白质的表达载体（含有目的基因的重组质粒）转化到相应的表达菌株里（一般常见的是DE3系列菌株），在大肠杆菌内，重组质粒上的目的基因在T7 RNA聚合酶作用下，发生转录翻译。表达菌株以及质粒都经过人工改造，正常情况下，E.coli体内T7聚合酶活性受到乳糖操纵子（Lac）控制，而能够调控Lac表达的组成元件被Lac阻遏物所抑制（Lac repressor），无法发生基因表达，而有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作用下，Lac阻遏物特异性与IPTG结合，从而解除Lac表达的控制，表达产生的T7聚合酶特异性结合到T7启动子区，从而转录目的基因进而翻译产生蛋白质。

4.蛋白纯化

带有标签的融合蛋白，标签蛋白可以与固化的亲和层（一般是离子螯合亲和）发生相互作用，标签蛋白上的一些特殊氨基酸与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质进行亲和纯化，一般常见用到的蛋白flag有GST、6X His、MBP，针对纯化蛋白的要求，蛋白的水溶性、提取量选择合适的标签flag。

5.体外反应及代谢物检测

将纯化好的蛋白，预期底物的标准版与辅酶后见体外酶活反应体系，加入相应的底物、辅酶和蛋白。配好反应体系后进行简单的混匀和离心，孵化，终止后，既可以在LC/MS-MS上检测底物的消耗和产物的生成。

参考文献：

Nett Ryan S,Lau Warren,Sattely Elizabeth S,Discovery and engineering of colchicine alkaloid biosynthesis.[J] .Nature, 2020, 584: 148-153.

Zhu G , Wang S , Huang Z , et al. Rewiring of the Fruit Metabolome in Tomato Breeding[J]. Cell, 2018, 172(1-2):249-261.e12.

Shi Qianqian,Du Jiangtao,Zhu Dajun et al. Ziziphus jujubaMetabolomic and Transcriptomic Analyses of Anthocyanin Biosynthesis Mechanisms in the Color Mutant cv. Tailihong.[J] .J Agric Food Chem, 2020, 68: 15186-15198.

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