PIC-seq：单细胞层面揭示存在物理作用的细胞互作

单细胞测序技术的提出，为我们提供了一个更精细的在单细胞细胞水平上的研究视野。但是值得注意的是传统的单细胞测序技术，如通过制备细胞悬液的方式来获得单个细胞，这个过程会破坏掉组织原始的空间结构，从而丧失了各种细胞在组织上的空间分布信息。而我们知道存在相互作用关系的细胞之间在空间上的分布具有聚集性，因此传统的单细胞测序技术就丢失了各种细胞空间分布的重要信息。

随后，单细胞空间转录组测序技术的提出在一定程度上为我们提供了各种细胞在原始组织上的空间分布信息，但是由于技术的限制，目前单细胞空间转录组测序技术每一个spot上都是几个甚至几十个细胞的混合体。因此，基于目前的空间转录组测序技术，我们仍无法真正在空间组上做到单个细胞水平的测序。

今天小编就来介绍一种技术：PIC-seq（physically interacting cells），这种方法采用了温和的组织解离手段，形成了能够很好的保留组织中细胞结构的细胞聚集体。随后，通过对物理接触的细胞聚集体的分析，实现高分辨率的细胞间相互作用研究。总体上说，这种方法结合了单细胞和PIC复合物的scRNA-seq数据，将每个测序的PIC复合物以计算的方式反卷积为两个或更多的单细胞。此外，PIC-seq通过比较PIC及参与的单个细胞来表征细胞间串扰下游的基因调控。

通过PIC-seq技术，研究者首先可以通过荧光激活细胞分选，从而分离出PIC。接着通过大规模平行RNA单细胞测序（MARS-seq）获取多个相互作用细胞的组合RNA谱的信息。然后，通过计算反卷积算法推定复合物的细胞组成，及PIC和单细胞中转录状态分布的比较模型，对PIC-seq数据进行分析。

下面小编就通过两篇有关PIC-seq技术的高分研究来系统介绍一下，如何巧妙的利用PIC-seq来开展我们自己的研究工作。

第一项研究也是PIC-seq技术最先提出时发表在Nature Biotechnology上的一篇文章。

作者首先使用PIC-seq分选系统对两种不同培养混合物进行了处理，但发现分选并不成功，杂散颗粒很少，且几乎没有PIC。于是乎还是之前一句老话，所谓技术不够，算法来凑。为了实现混合粒子反卷积，作者开发了一种回归策略，给每种混合物中相互作用的细胞类型赋予一个值（UMI, unique molecular identifier）。根据在每个谱系中观察到的各细胞类型的特定信息，高精度地模拟推导估计混合因子。

该方法结合了单细胞和PIC复合物的scRNA-seq数据，将每个测序的PIC复合物以计算的方式反卷积为两个或更多的单细胞。此外，PIC-seq通过比较PIC及参与的单个细胞来表征细胞间串扰下游的基因调控。作者还使用PIC-seq在体外和体内研究了T细胞与树突状细胞的相互作用，以表征相互作用特异性及其激活的基因表达程序。

作者首先在体外模型中验证PIC-seq的可行性，将CD11c+ DCs（用LPS和抗原激活）和CD4+ T细胞（卵清蛋白特异性αβ-TCRs）进行不同时间的单独培养和共培养（3 h，20 h，44 h）后，分别用PIC-seq进行测序、FACS分选共培养的T细胞-DC PICs，得到TCRβ和CD11c双阳性的细胞占5.68 ± 0.53%。分析单一的T细胞或者DC细胞以及PICs的基因表达和细胞成分，结合单细胞模型数据和每个PICs的UMI分数，可推断出每个PIC的最大可能组合，表明PIC-seq可用于相互作用细胞的分析。

然后，研究者在野生型小鼠耳廓皮内注射荧光标记的巴西日圆线虫（Nb）或磷酸盐缓冲溶液（PBS）。注射48 h后，获得引流淋巴结的T细胞-抗原递呈细胞（APC）PICs。通过流式细胞术分析，研究者发现TCR+ 和CD11c+ 细胞群占总群的0.31 ± 0.06%，并使用共聚焦显微镜来评估组织的离解和对PICs的分选效率。结果表明T细胞和APC存在高度异质性。

因此，研究者通过转录本信息将其划分为多个亚群。通过分析结果，作者发现，在PICs中富集了Treg和CD8记忆T细胞。与PBS对照组相比，注射了Nb的PICs中单核细胞数量增加。与体外共培养实验结果相似，PICs间的差异表达高度依赖于T细胞和APCs的类型。

研究者接下来通过对T细胞和髓系细胞进行PIC-seq发现，在引流淋巴结中无论是PBS对照组，还是注射Nb样本，调节性T细胞（Treg）和髓系细胞之间的相互作用频率很高。

为了验证Treg细胞与APCs相互作用的能力，研究者使用FACS和共聚焦显微镜来表征表达Foxp3荧光报告基因的转基因小鼠PICs和单个细胞中的Treg频率。结果表明，T细胞和DC 细胞的PICs中Treg比例（23.3%）高于单独T细胞中的Treg比例（4.55%）。Nb样本来源的T细胞-DC PICs特异性上调了趋化因子Ccl22和Ccl17，共刺激因子Cd40、Ebi3和Dll4基因，表明了注射Nb样本来源的特异性细胞相互作用。

因此，PIC-seq能够表征细胞与细胞之间的相互作用，对于识别细胞-细胞相互作用信号分子的新靶点具有很大的潜力。

总的来说，这项研究首次提出了一种基于细胞分选和测序的新方法——PIC-seq，它可以用于分析原本在物理上结合的多种细胞类型之间的相互作用，以确定相互作用的特异性和被这些相互作用激活的基因表达程序，有望应用于传染病、肿瘤免疫和免疫治疗等领域的研究。

当然，PCI-seq还存在一些局限性，比如不同的解离方法对特定的相互作用对表现出偏好，所以不能捕获在体内发生的全部相互作用。此外，PIC-seq算法要求相互作用的细胞在转录上不能太相似，才能成功地反卷积。因此，它不能直观地应用于由相似或相同的细胞组成的双重态的研究，有待未来进一步优化和解决。

接下来要介绍的一篇研究是利用PIC-seq研究肿瘤微环境中存在的细胞相互作用，于今年发表在Nature cancer 杂志上。

肿瘤微环境不仅影响肿瘤的发生发展，而且和免疫治疗应答密切相关。限于肿瘤微环境高度的异质性，和复杂的细胞作用关系，传统的研究方法已无法准确揭示肿瘤微环境各细胞之间的相互作用。因此基于单细胞测序的各种相关技术，为我们提供一个崭新的视野深入解析肿瘤微环境中的免疫学机制。

在这项研究中，作者通过PIC-seq对人非小细胞肺癌(NSCLC)进行分析，详细描述了CD4+辅助T细胞与树突状细胞的相互作用，并且作者在体外和卵清蛋白特异性αβTCRCD4+T-t细胞模型中重建了它们的相互作用，发现了Tht程序由呈现肿瘤抗原的树突状细胞在肿瘤淋巴结中启动，这些功能对于利用抗PD-1治疗的抗肿瘤反应非常重要。

为了清楚的揭示NSCLC的TME中髓系细胞和T细胞之间的相互作用，研究者将PIC-seq技术应用于早期NSCLC病变的临床样本中进行研究。研究者通过对早期未接受治疗的手术切除的10例NSCLC组织，与邻近未发生癌变的正常组织进行了PIC-seq测序，构建了NSCLC患者的PIC图谱。

随后，研究者使用MetaCell算法将PIC-seq数据进行了整合，建立TME和健康组织中单细胞状态的背景模型，同时根据基因表达将T细胞进行分类：迁移T细胞，幼稚T细胞，增殖T细胞，CD4+激活T细胞，CD4+记忆T细胞，CD8+T细胞，CD8+细胞毒性T和CD8+功能失调T细胞。

紧接着，研究者同样根据VCAN或CD31基因的表达情况将骨髓细胞分为单核细胞的两个子集，并且将剩余的髓系细胞亚群分为四种树突状细胞亚型，即：表达DC的单核细胞基因、经典DCI型树突状细胞、经典DCII型细胞和富含免疫调节分子的成熟树突状细胞。

通过分析结果，研究者发现肿瘤组织和邻近无肿瘤组织之间的细胞组成存在一致的差异，他们计算了每个标本的TME与健康细胞状态的比率，并量化了子集丰度之间的相关性。结果与之前对NSCLC病变的的单细胞分析一致，因此这个结果可以作为研究TME中定义细胞相互作用的分子程序的基线。

进一步的通过结合多重免疫荧光和其它技术，研究人员发现，表达CD4标记（cluster determinant 4），PD-1（程序性死亡配体1）和CXCL13（C-X-C基序趋化因子配体13）的T细胞，是NSCLC肿瘤微环境中形成与抗原呈递树突状细胞相互作用的主要枢纽。

随后，作者将这群新发现的肿瘤特异性很高，且基因相同（克隆）保守的T细胞命名为辅助性肿瘤T细胞（Tht）细胞。此外，研究者发现在肿瘤微环境中Tht细胞比效应CD8+T 细胞更倾向于与树突状细胞发生相互作用。

为了更好地了解Tht细胞在体内的时空分布核分化动态，作者利用小鼠模型，将B16-OVA细胞移植到WTC57BL/6J受体中。随后在肿瘤注射后10天和17天，对从肿瘤引流淋巴结(tdLNs)和颈部周围淋巴结(cLNs)中分离的12154个阳性单TCRβ+T细胞进行MARS-seq测序。结果发现，抗原特异性的CD45.1+TCRβ+OT-II T细胞上调了从体外研究中衍生的Tht细胞特征、tdLNCD45.1+TCRβ+OT-IIT细胞上调了T细胞激活特征、体内Tht细胞特征与幼稚t细胞基因的表达减少相关，并与细胞周期基因的表达相关。

接下来，作者研究了Tht细胞的细胞动力学，及其从tdln向TME迁移过程的工作机制。研究者收集并分析了内源性TCRβ+ T细胞，并在第10和17天从TME过继转移OT-IICD45.1+ TCRβ+ T细胞，以及在肿瘤注射后第10天从tdLNs和clns的细胞。结果表明，与肿瘤浸润的T细胞显著上调Tht相关的激活程序。

为了进一步研究Tht细胞的状态是否和tdln中与DC的物理相互作用，特别是抗原提呈功能相关，在注射肿瘤细胞后的第10天，也就是Tht细胞在tdln中积累较多时，研究者从tdLNs和cln中分离3406个qc阳性cD11c+ 髓系细胞进行了MARS-seq，并使用MetaCell算法对它们进行分析。同时，为了更好地定义抗PD-1治疗后Tht细胞的分子重编程，作者对肿瘤注射后17天内来自过继转移小鼠tdln的2867个多克隆TCRβ+和OT-IICD45.1+TCRβ+T细胞进行了MARS-seq。通过整合所有的分析结果，研究者证实Tht细胞直接参与了抗pd-1抗体的抗肿瘤疗效，并揭示了mTht细胞在抗pd-1治疗后的分子重编程功能机制。

总的来说，这项研究首次利用PIC-seq技术揭示了人类NSCLC病灶中CD4+PD-1+CXCL13+ T细胞(Tht)与DC-LAMP+ mregDCs之间存在的相互作用。研究者首次发现Tht细胞在TME中优先与DC相互作用，而不是效应CD8+ T细胞。

同时，通过进一步使用实验小鼠模型，作者揭示了Tht细胞的分化、扩张和维持，与tdln和TME中的肿瘤抗原呈递相关。PIC-seq在揭示细胞-细胞物理相互作用方面的无偏性为探索肿瘤免疫的复杂相互作用动力学提供了意想不到的效果。这项研究的数据表明，TME中至少存在两种不同的T细胞群，CD8+效应/功能障碍T细胞和Tht细胞，它们通过克隆扩展重塑TME，对肿瘤抗原呈递做出特异性反应。

然而，这项研究并没有清楚的揭示Tht细胞在TME中与其他免疫细胞之间的结合作用，如Treg、效应T、髓系细胞和NK细胞。在未来的研究中，如果能全面揭示这些Tht细胞如何通过和其它免疫细胞之间的相互作用，从而促进或抑制肿瘤的免疫杀伤机制，特别是患者在免疫治疗的过程中发生的相互作用，将会为我们更全面的认识肿瘤微环境的工作机制提供重要依据。

细胞之间的通讯交流不仅是组织维持发育和稳态的基础，也是很多疾病发生发展的本质，包括肿瘤。在每个器官组织的功能部位，细胞通过物理空间上的相互结合作用进行通讯，并交换代谢产物、配体-受体信号和形成细胞网络。其中，免疫细胞参与了许多类型的物理相互作用，从而促进组织修复、吞噬作用和细胞死亡等生理过程。

在免疫系统中，T细胞与抗原呈递细胞的物理相互作用就是一个十分重要的范例。这种相互作用对于免疫系统区分自身和非自身的能力至关重要，当CD4+ T细胞与抗原呈递细胞发生物理相互作用时，会在T细胞受体上形成一个免疫突触和在MHC-II分子上呈现抗原。根据T细胞受体对所呈递抗原的亲和力和共刺激分子的存在，这种相互作用可以激活胞内信号传导和基因表达，从而导致特定的免疫决定。

尽管我们一直都清楚物理上相互接触的细胞簇是一个功能单元，它们之间的直接相互作用是影响很多疾病，特别是肿瘤发生发展的主要决定因素。但目前对于体内各种细胞与其它免疫细胞，尤其是T细胞核树突状细胞相互作用的转录调节和串扰的表征仍然很困难。共培养的体外测定法或显微镜技术与具有不变T细胞受体的转基因小鼠模型相结合尽管有效，但在分辨率和背景方面有一定的限制。而单细胞RNA测序在组织解离的过程中会消除细胞结合物。

因此，PIC-seq技术的提出就为我们提供了一种崭新的手段直接研究在物理上存在相互作用的细胞之间的功能交流。基于这项革命性的技术，即使通过消化会破坏掉组织原有的空间结构，但我们仍然可以精准捕获到本身存在物理作用的细胞簇。

不过需要注意的是，目前使用PIC-seq技术进行研究的文章主要都是由其开发者所在的以色列实验室所发表的，所以目前小编推测这种技术还没有得到推广。但是小编相信这种技术在未来会被商业化推广，或者会有类似的技术被开发出来。同时，基于这种技术的数据和相应软件作者都已经公开，大家可以挖掘已经发表的PIC-seq数据来用于自己的研究中。

参考文献

1.Giladi A, Cohen M, Medaglia C, Baran Y, Li B, Zada M, Bost P, Blecher-Gonen R, Salame TM, Mayer JU, David E, Ronchese F, Tanay A, Amit I. Dissecting cellular crosstalk by sequencing physically interacting cells. Nat Biotechnol. 2020 May;38(5):629-637. doi: 10.1038/s41587-020-0442-2. Epub 2020 Mar 9. PMID: 32152598.

2. Cohen M, Giladi A, Barboy O, Hamon P, Li B, Zada M, Gurevich-Shapiro A, Beccaria CG, David E, Maier BB, Buckup M, Kamer I, Deczkowska A, Le Berichel J, Bar J, Iannacone M, Tanay A, Merad M, Amit I. The interaction of CD4+ helper T cells with dendritic cells shapes the tumor microenvironment and immune checkpoint blockade response. Nat Cancer. 2022 Mar;3(3):303-317. doi: 10.1038/s43018-022-00338-5. Epub 2022 Mar 3. PMID: 35241835.