NIR-II 探针 | 磷酸化胆碱共轭金分子簇改善了临床前癌症模型中淋巴结NIR-II荧光成像的信号

2022-10-28 03:49:03, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：前哨淋巴结成像和活检对肿瘤转移的临床评估很重要，近年来，新型非放射性淋巴示踪剂一直在积极研究。作者开发了磷酸化胆碱(PC)配体功能化的金分子簇(Au25)，用于4T1小鼠乳腺癌和CT26结肠癌小鼠模型的引流淋巴结的NIR-II (1000-3000 nm)荧光成像。自磷酸化胆碱(Au-PC)探针表现出“超级隐身”的行为，与体内的血清蛋白、细胞和组织很少相互作用，这与吲哚菁绿(ICG)染料不同。皮下注射Au-PC可在注射后0.5 ~ 1小时内通过NIR-II荧光成像进行淋巴结定位，随后可快速被肾脏清除。临床前NIR-II荧光LN成像具有较高的信底比和较高的安全性和生物相容性，有望在未来的临床转化。

背景：前哨淋巴结(SLN)是肿瘤的原发引流淋巴结，肿瘤首先发生转移。肿瘤细胞从瘤周淋巴管向SLN扩散，然后向远处的淋巴结扩散，开始恶性肿瘤细胞的淋巴扩散。SLNB活检(SLNB)是一种标准的癌症分期方法，包括瘤周给药放射性同位素、染料示踪剂或两者结合用于SLN的鉴定。SLN通常在10-60分钟(有时几个小时)内可见，然而，一些危险因素会导致漏检率为2 - 28%。淋巴闪烁造影的缺点包括缺乏核医学设施或缺乏获得放射性药物的途径。涉及放射性的操作对医护人员构成一定的风险。此外，对于某些患者群体(如孕妇)，放射治疗通常被排除在外。磷酸胆碱及其衍生物在体外和体内具有高度的生物相容性，它对固体表面的非特异性蛋白质相互作用具有高抵抗力。由此产生的Au-PC簇被发现在体内表现为“超隐身”探针，而不与ICG等血清蛋白结合或像母体Au-GSH簇那样具有非特异性骨蓄积，从而允许在肿瘤内或皮下注射的几分钟内对小鼠淋巴结进行成像。Au-PC簇在注射部位几乎没有保留，并且在24小时内从体内达到接近100%的肾脏排泄。我们相信Au-PC分子簇可能是用于NIR-II荧光淋巴结成像的有希望的探针，供人类在临床上使用。

研究内容：作者首先在水相中合成了Au-GSH簇（图1，a），然后通过EDC / NHS化学在MES pH 7.0缓冲液中将簇共价地与4-氨基苯基磷酰胆碱（PC）配体共价连接，然后纯化以获得Au-GSH-PC偶联物（以下简称Au-PC，图1，b）。Au-GSH簇的后功能化和金-PC共轭结构的示意图（图1，b）。水相中Au-GSH簇的紫外可见吸收和荧光光谱（图1，c）。平均尺寸为1.64纳米的金质激素簇的冷冻电镜显微±0.24纳米（n = 3）（图1，d）。从冷冻电镜显微照片获得的金-GSH簇粒径分布的描述性统计分析（图1，e）。Au-GSH簇在负离子模式下的ESI-MS谱图谱从m/z 1000到3000：鉴定出5–8个带负电荷的物种，其余峰很小，归因于杂质簇/物种。（图1，f）

图1：Au-GSH簇的表征和功能化

之后，作者选择了静脉、肿瘤内和皮下注射Au-PC、Au-GSH和ICG，活体NIR-II > 1100 nm荧光成像。实验开始前，作者做了Au-GSH簇和Au-PC偶联物的细胞毒性试验和血清蛋白结合率的实验。首先是细胞毒性试验，在体外条件下，当4T1小鼠乳腺癌细胞和CT26结肠癌细胞以不同质量浓度的簇孵育时，在37°C下以1mg / mL，5mg / mL浓度下12小时，作者观察到Au-GSH和Au-PC簇没有细胞毒性。紧接着，作者评估了Au-GSH簇和Au-PC偶联物与FBS的血清蛋白结合能力，并与ICG进行了比较。Au-GSH簇、Au-PC偶联物和ICG的血清蛋白结合效率分别为2.7%、1.74%和94.5%。也就是说，大多数94.5%的ICG被发现与血清蛋白结合并且无法通过过滤器。而Au-GSH和Au-PC都显示出与血清蛋白的相互作用要低得多，尤其是Au-PC。

作者随后做了静脉中，活体NIR-II > 1100 nm荧光成像。在体内，实验首先通过尾静脉注射将溶解在PBS中的Au-GSH和Au-PC簇静脉内施用于小鼠（5-7周龄的女性Balb / c，每组n = 3），在>1100nm NIR-II窗口中成像并与临床批准的ICG染料并排比较。由于肾脏引流快速肾脏清除的结果，小鼠的膀胱NIR-II信号在注射后约3分钟（图2，a b腹侧视图）迅速亮起。ICG被证明具有延伸到>1000 nm NIR-II窗口的荧光尾对于静脉注射ICG，在肝脏和肠道中观察到强烈的NIR-II信号，与ICG-血清蛋白结合复合物形式的胆汁排泄途径一致65（图2，c）。注射后24小时后，身体信号被清除，主要器官中没有显着的ICG保留。Au-PC和Au-GSH荧光探针后24小时在主要器官中的生物分布（图2，d e）。来自未经治疗的小鼠的苏木精和曙红（H&E）染色的主要器官的组织学切片显示没有差异，表明静脉注射的Au-PC探针在体内具有很高的安全性。（图2，f）

图2：静脉注射的金-PC，金-GSH和ICG的体内荧光成像

之后，为了观察肿瘤内，活体NIR-II > 1100 nm荧光成像，作者对携带同源4T1小鼠乳腺肿瘤的小鼠（5-7周龄雌性Balb / c，每组n = 3）和接种在后肢上的CT26结肠肿瘤，施用了几剂Au-PC探针（图3a)，引流腹股沟淋巴结，在约1分钟内开始显示Au-PC的NIR-II发射，并在3分钟内达到高亮度（图3a）。LN信号在峰值30分钟达到峰值强度后，在排水iLNs中持续超过1小时（图3a），LN/背景信号比〜5-10（图3d）。10分钟内，作者观察到淋巴管中的Au-PC 在NIR-II发射，从iLNs到达腋窝区域，并弱标记4T1和CT26小鼠模型的腋窝LN（aLN）。信号在Au-PC探头的30分钟后完全消失。

图3：肿瘤内注射的金-PC，金-GSH和ICG的体内荧光成像

作者将Au-PC和Au-GSH探针相比，观察到ICG表现出截然不同的SLN引流动力学（图3c）。ICG信号首次出现在SLN中的时间比Au-PC和Au-GSH的次数长，并且因小鼠而异，在内侧注射后10分钟-30分钟的范围内注射到4T1肿瘤中。与静脉注射病例类似，肿瘤内注射的Au-PC和Au-GSH探针通过肾脏途径从体内排泄出来（图4），而ICG通过肝脏排泄系统排出。在24小时内，对排泄物的ICP-MS分析显示，约92%的注射Au-PC样品通过尿液排泄（图4a，b），而用Au-GSH观察到仅38%的尿排泄（图4c，d）。对于Au-PC探针（图3a），观察到来自肿瘤注射部位和小鼠身体的接近完全的信号褪色24小时（图3a），同时在肿瘤注射部位仍然检测到Au-GSH（图3b）和ICG探针（图3c）的显着信号。与ICG和Au-GSH相比，Au-PC簇在注射部位和体内表现出最小的捕获和保留，这表明Au簇的高度隐身性归因于表面磷酸胆碱配体赋予最小的相互作用以及与体内蛋白质，细胞和组织/器官的非特异性结合。

图4：肿瘤内注射Au-PC和Au-GSH后的排泄曲线和生物分布

接下来，为了比较肿瘤内注射Au-PC和Au-GSH后的代谢和分布，作者在小鼠尾巴基部注射三个探针后LN引流（5-7周龄的女性Balb / c，每组n = 3）。在3分钟内的Au-PC簇迁移到连接注射部位和引流iLN的淋巴管（图5a）。iLN中的强信号在长达1小时内可见，并且在2小时时降低约40%（图5d）。在24小时内，Au-PC信号从体内消失，在注射部位几乎没有保留。在注射的Au-GSH簇的情况下，iLN中的信号在30分钟达到峰值，2小时减少〜50%，并且在24小时时大部分从注射部位消失，但在中央骨骼框架中观察到显着信号（图5b，e）。在24小时内，ICP-MS分析显示，注射的Au-PC样品的约92%通过尿液排泄，而用Au-GSH观察到〜71%的尿液排泄。相反，在IGG给药时（图5c），iLN中的荧光信号出现3分钟，但与注射后同时使用Au-PC探针的强度相比要低得多（图5f）。在2-3 h后（甚至更晚），iLN中的ICG信号达到峰值强度并持续存在。即使在24小时后，显着信号仍然保留在淋巴结，注射部位和肝脏中（图5f）。ICG在注射部位的保留持续了很长一段时间（图5F），比Au-PC长得多。

图5：皮下注射金质PC，金-GSH和ICG的体内荧光成像

为了比较Au-PC和ICG 探针在各种NIR子窗口中进行淋巴结成像，作者进行了1倍剂量的Au-PC（图6a）和ICG（图6b）（5-7周龄的女性Balb / c，每组n = 3）的肿瘤内注射，并通过检测探针的NIR-II发射（在相同的808nm激发下）来比较LN成像在各自峰值强度时间点的引流iLN中增加波长。我们分析了基于Au-PC和ICG的LN成像在>900 nm，>1100 nm，>1200 nm和>1300 nm发射窗口下的全宽半最大值（FWHM）（图6C）。随着发射波长的增加，横截面轮廓的增宽明显减小，淋巴结半最大值（FWHM）的实测全宽从3.8、3.5、3.2mm下降到2.8 mm（图6c），表明在较长时间发射时成像分辨率增加。LN/B 比值也有所增加，并为 Au-PC 提供了更高的 LN/B 比，特别是在 >1300 nm 成像范围内（图 6d）。在>1300 nm发射下测量的Au-PC的LN/B比值达到~22（图6d），可以清晰地识别/成像主层节点。

图6：各种NIR子窗口中的淋巴结成像

总结：本文研究了具有NIR-II荧光的分子金纳米簇，用于同源4T1小鼠乳腺和CT26肿瘤小鼠模型中的SLN检测和定位。在水溶液中合成提供了L-谷胱甘肽包被的Au簇，并且与磷酸胆碱配体（Au-PC）的进一步功能化导致了高度生物相容的“隐形”NIR-II探针。由于磷酸胆碱配体是生命系统固有的安全生物分子，Au-PC分子簇在体内表现出“超隐身”行为方面是独一无二的，与蛋白质，细胞和组织的相互作用/结合可以忽略不计，并且通过尿液排泄，无论注射途径如何（静脉注射，肿瘤内或皮下注射）。i.t.和s.c.注射的Au-PC在几分钟到几小时内迅速迁移到引流淋巴结。肿瘤内给药后Au-PC的LN引流药代动力学进入4T1肿瘤和CT26肿瘤的小鼠，在~1 min内到达引流腹股沟淋巴结，并以峰值强度持续30 min~1 h，在后期时间点逐渐消退。Au-PC探头允许在注射后几乎立即排出LN成像，并提供〜1-2小时的成像窗口。Au-PC和ICG都表现出1000-1400范围内的NIR-II荧光，低发射尾部>1300 nm。>1300 nm范围内的成像在穿透深度、信号/背景和图像清晰度方面是最佳的，但需要更长的曝光时间（约400 ms）。Au簇（Au-PC和 Au-GSH）没有扩散和非特异性结合行为，允许对dLNs进行更清晰，更有针对性的成像。这一重要特性将Au分子簇与菁染料区分开来，并被报道为减缓正常血管簇外渗并增强其对癌组织的靶向的方法。

参考文献

https://doi.org/10.1038/s41467-022-33341-6

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