10分钟完成抗体偶联药物多属性分析！实现ADC药物表征高通量！

2022-10-18 13:28:44, 质谱成像先锋队布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates, ADCs）是一类非常有前景的人类癌症治疗药物。抗体偶联药物通过稳定的连接子，将强效的细胞毒性药物与单克隆抗体共价结合。该治疗性生物分子将单克隆抗体药物的高特异性和小分子细胞毒药物的高活性相结合，用以提高肿瘤药物的靶向性并减少副作用，在人类与肿瘤等疾病的斗争中扮演着重要角色。

由于抗体偶联药物结构的高度复杂性，对其进行完整的表征是一项具有挑战性的任务。除了初始单抗的异质性，偶联策略还带来了额外程度的可变性。因此，针对ADC药物一级序列变异、药物/抗体比率（DAR）以及药物偶联引起的单抗结构变化等进行多属性监测，对于确保药物的安全性和有效性是非常必要的。而开发出对抗体药物多种质量属性进行快速而稳定的监测流程，对于药物临床前开发和质量控制分析都尤为重要。

目前，液相色谱（LC）和高分辨率质谱（HRMS）联用技术是对药物的多维度属性进行表征最常用的工具，但其仍面临诸多挑战，例如：1.基于质谱的鸟枪法在多肽层面进行分析，前处理时间较长，而且在前处理过程中可能引入一些人工修饰，限制样本分析通量；2. 多肽层面分析药物/抗体比率（DAR）存在一定困难；3. 仅仅依靠基于质谱的完整蛋白分析流程很难获得蛋白结构变化和位点及序列突变信息。因此，亟需开发分析时间短，能够实现高通量，而且能够同时实现对药物多个维度的监测分析方法。

近期，威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授及其团队开发了一种高通量的抗体偶联药物表征方法，该方法利用布鲁克捕集离子淌度质谱timsTOF Pro，结合自上而下质谱（MS）方法分析半胱氨酸连接的抗体偶联药物^[1]。

该方法结合离子淌度高分辨质谱，单针直接进样可在三个层面实现对抗体偶联药物（~150 kDa）的多属性分析，包括表征非共价结合的完整蛋白（MS1）、碰撞激活时解离的完整亚基（MS2）和在更高的碰撞能量下释放的亚基序列碎片（MS3），实验流程如图1所示。利用timsTOF Pro开创性的捕集型离子淌度分离技术，实验绕开了复杂的多种液相分离手段，采用质谱直接进样，而且对质谱参数进行分段式设置，得以在3分钟的有效数据采集时间内完成三个层面的多属性分析，实现高通量的抗体偶联药物表征，获得丰富药物分子信息。

图1. 药物表征实验流程

与常用的完整蛋白分析方法相比，timsTOF Pro在分析完整抗体偶联药物时具有明显的优势。当不进行前端分离而直接进样时，不同药物/抗体比率（Drug-to-antibody-ratio, DAR）类型的电荷状态分布重叠会抑制丰度较低的类型，如DAR8（图2A，TIMS关闭时谱图），这对计算抗体偶联药物药物/抗体比率的平均值会产生不利影响。而当打开TIMS淌度功能时，timsTOF Pro在淌度维度增加额外一维分离，而且淌度聚焦分离技术的引入会显著增强谱峰信噪比。除此之外，TIMS分离区域还可以观察到不同DAR类型的丰度变化（图2B-I）。

图2. TIMS off（A）和TIMS on（B-I）MS1谱图比较

样本直接进样进行MS1分析（图3A）之后，通过增加ccCID（Collision cell CID）或isCID（In-source CID）的碰撞能量可以对解离的单个非共价连接的亚基进行MS2表征。实验结果显示游离亚基中最丰富的是与药物分子结合的轻链（Lc1）（图3B）。原本轻链与重链（Hc）通过单个链间二硫键连接，但在半胱氨酸连接的抗体偶联药物中，药物与Lc结合导致其与Hc成为完全非共价键结合。在MS2游离亚基表征之后，进一步增加isCID和ccCID的碰撞能量，同时采用CID和bbCID（broadband CID）即可实现对序列进行MS3表征（图3C-F）。

图3.采用布鲁克 timsTOF Pro对非变性抗体偶联药物进行多属性分析

MS2对亚基进行表征后，在MS3层面增加ccCID的碰撞能量对氨基酸序列进行分析。对于15min分析时间，分别采取在3个5min时间使用80Ev, 90Ev, 100Ev能量获得的碎片（图4A）以及3种能量阶梯式变化，每种能量间隔30s变化获得的碎片信息结果（图4B）, 获得可能产生的213种多肽碎片里的17和13种，尽管序列覆盖度有限，结果仍然可以有效确认药物结合并定位链间二硫键。同时，对比傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（FTICR-MS）分析结果，残基检测率由2.3%提升到8%（17/213）左右^[2]，显示TIMS质谱仪出色的灵敏度和分离能力。

图4.轻链氨基酸序列多级质谱碎裂分析

为了进一步提高分析通量，研究团队将分段式质谱采集策略应用于单次直接进样分析（图5）。通过将10min的直接进样分析拆分为多个不同30s区间，质谱参数每30s切换一次，得到独特的综合定性结果。实验结果显示，仅3min有效分时间，从一次进样中即可实现对抗体偶联药物进行完整的三级定性分析。首先，对完整的ADC进行MS1分析，并同时进行TIMS分离（图5A）；其次，通过CID释放非共价连接亚基（图5B），MS2水平检测完整亚基质量；最后，对一级序列进行CID表征，得到序列碎片谱图（图5C），并筛选出3个ccCID能量进行MS3序列深度表征（图5D-F）。

图5. 分段式质谱采集策略应用于单次直接进样分析

综上所述，葛英团队利用了布鲁克timsTOF Pro独特的捕集离子淌度分离技术在谱图简化和信噪比上的提升，以及提供额外一维淌度分离带来的优势，开发了一种超快速、高通量的分析方法，在10min的单次进样中即可对半胱氨酸连接的抗体偶联药物进行多维分析。该策略单针进样即可实现完整蛋白，亚基以及氨基酸序列三个层面的质谱分析，而且样本基本不需要前处理即可进样进行分析，大大缩短了前处理时间，提升分析效率。相信此方法凭借其独特的优势，将在临床前抗体药物快速筛选和药物质量控制等领域大有可为。

参考文献：

[1] Larson EJ. et al. High-Throughput Multi-attribute Analysis of Antibody-Drug Conjugates Enabled by Trapped Ion Mobility Spectrometry and Top-Down Mass Spectrometry. Anal Chem. 2021;93(29):10013-10021.

[2] Larson EJ. et al. Rapid Analysis of Reduced Antibody Drug Conjugate by Online LC-MS/MS with Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Anal Chem. 2020;92(22):15096-15103.

[3] Meier, F. et al. Online parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol. Cell. Proteomics. 2018;17,2534–2545.