2022-10-13 00:50:07, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司
很多小伙伴觉得色谱柱更换太频繁了,经费在燃烧,但其实我们应该对色谱柱寿命有个合理的期望,一位色谱学家Ron Majors的发现。在他发表的文章中,他对色谱柱的寿命做了一些调研。图1是他在文章中对2011年调研得到的数据,我们可以看到有将近3/4的受调研者可以得到至少500针的进样次数(24% + 47% = 71%),而将近一半的可以得到至少1000针的进样次数(47%)。这是很令人惊讶的结果,因为这个调研包括了各种不同类型的色谱柱,而不只是针对一般比较常用和耐用的150 mm × 4.6 mm规格、粒径为5 μm的反相色谱柱。
2011年每支色谱柱寿命结束前的进样量调研结果
1997-2011年色谱柱寿命结束前进样量的比较
时间越往后退,大于1000针的比例在上涨,这个原因也可归结为实验人员能够更好的利用色谱柱,在使用上更加注意使得寿命增长。
不同基质的样品对色谱柱的污染程度不一样,色谱柱的寿命就不一样了,根据样品基质,含蛋白和其他常规样品,单独配一根色谱柱,这样就可以保证低污染样品的色谱柱寿命。也可以根据样品基质的不同设计不同的冲洗程序,更好的维护色谱柱。
影响色谱柱寿命的两个主要因素是样品中的杂质和颗粒,因此如果我们能够在进样前去除样品中的杂质和颗粒,色谱柱的寿命一定会延长。前处理的方法包括固相萃取(SPE),液液萃取和其他的过滤方法,建议所有的样品在进样前经过过滤或是离心处理。
使用在线过滤器是HPLC或UHPLC仪器上最有经济效益的部件。在线过滤器放置在自动进样器和色谱柱(或是保护柱)之间,常用的在线过滤器分为含有可替换筛板(0.5 μm或0.2 μm)的不锈钢在线过滤器以及一次性的PEEK材质的在线过滤器,一般必须选择比柱筛板孔径更小的筛板,这样才能有效拦截可能堵塞色谱柱筛板的颗粒。一旦发现仪器的压力开始增加,可能在线过滤器筛板开始堵塞了,我们必须在其被完全堵塞前更新。
使用保护柱,一般是1-2 cm长,装的填料和使用的色谱柱填料相匹配,而使用的筛板孔径不会比色谱柱中使用的筛板孔径大。保护柱有两种功能:(1)可以阻挡可能堵塞色谱柱的颗粒;(2)因为保护柱和色谱柱填料相匹配,任何可能和色谱柱填料产生不可逆作用而不出峰的化学杂质,会被保护柱先行捕获。
当系统中出现压力升高、肩峰、拖尾等异常情况时,多数情况下是由于保护柱受到污染导致。
判断保护柱污染的方法:
(1)连接保护柱进一针标品
(2)取下保护柱进一针标品
对比二者谱图,若(1)和(2)峰形都不正常,则色谱柱和保护柱都受到了污染,需要分别清洗色谱柱和保护柱;若(1)峰形不正常,(2)峰形正常,则保护柱受到了污染,需要清洗保护柱。
保护柱的清洗:
建议对保护柱进行单独清洗,清洗时,断开保护柱与色谱柱的连接,反向用95%水+5%甲醇冲洗,1ml/min,10分钟。
1.实验开始之前的冲洗
防腐剂流动相中含有大量缓冲盐,为了防止盐析,每次正式实验之前一定要用95%水+5%甲醇冲洗10倍柱体积后再走方法流动相开展实验,这一点很关键,很容易被一些实验员忽视。
2.实验结束之后的冲洗
如果第二天继续实验的话,则不需要特别清洗色谱柱,不要停泵,保持流动相处于流动状态。
如果第二天不继续实验,需要对色谱柱进行充分的冲洗,冲洗的要点就是高水相、低流速、长时间。建议按照以下方案冲洗:
95%水+5%甲醇,0.5ml/min 流速,过夜冲洗色谱柱,再过度到纯甲醇或乙腈保存色谱柱。
3.色谱柱污染后的冲洗:
当出现拖尾、分叉等异常谱图,有时也会伴随压力上升的现象,说明色谱柱受到了污染,污染严重的色谱柱柱头填料甚至会变色。此时,色谱柱需要进行充分的冲洗
色谱柱的污染一般发生在柱头,所以一般将色谱柱进行反向冲洗,这样污染物不需要经过整个柱体而被很快冲洗掉,冲洗色谱柱请将检测器断开以防止污染物进入检测器。
测试不同样品基质的色谱柱冲洗方法不同:
常规样品:95%水+5%甲醇,0.5ml/min过夜反冲,反冲后,正向测试;
蛋白质较高样品:1%三氟乙酸:乙腈 95:5,0.5ml/min反冲过夜, 然后85%水+15%乙腈0.5ml/min反冲3小时,反冲后,正向测试。
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