染料探针 | 结构改造黄原稀染料体系实现大于1300 nm NIR-II血管造影

2022-10-12 19:19:28, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：近红外二区（NIR-Ⅱ）窗口的荧光生物成像可以提供具有低背景信号的精确图像。根据单体的固有发射，实现有机荧光团的吸收/发射波长超过1300 nm是具有挑战性的工作。减少聚集荧光淬灭（ACQ）效应是在理想区域实现荧光生物成像的有效策略。本文报道了两个在相同骨架上具有不同侧链的NIR-Ⅱ氧杂蒽荧光团（CM1和CM2），及其相应的组件CM1 NPs和CM2 NPs。其中CM2 NPs显示出ACQ效应的显著降低，最大吸收/发射波长拓展至1235/1250 nm。CM2 NPs可以高分辨率区分邻近的动脉与静脉，并且可以实现超过1300 nm的血管造影，分辨小至0.23 mm的毛细血管。

近红外二区（NIR-Ⅱ，1000 -1700 nm）窗口的荧光生物成像具有高灵敏度、深穿透深度（~ 1.5 cm）和高成像质量与对比度等优良性质,近几年得到飞速发展。开发具有足够亮度的NIR-Ⅱ荧光团对于更先进的NIR-Ⅱ生物成像至关重要。目前已开发的NIR-Ⅱ有机荧光团主要包括聚亚甲基、苯并噻二唑衍生物、氧杂蒽衍生物、BODIPY衍生物等。广泛拓展π共轭结是将吸收/发射波长红移到NIR-Ⅱ窗口的一种有效策略，但由此带来了结构优化的挑战。1）长波长荧光燃料由于其最高占据分子轨道（HOMO）能级高而通常不稳定且易被氧化。2）由于其表面疏水性，大的π共轭染料容易形成H-聚集体和遭受ACQ效应。因此，该策略并不适用于通过静脉注射进行明亮精细的荧光成像。为了减少H-聚集体导致的ACQ效应，J-聚集体和聚集诱导发光（AIE）物质被广泛使用。然而，这些策略仍受到复杂的制备过程和低于1200 nm的本征发射的限制。

本文合成了两个在相同骨架上具有不同侧链的NIR-Ⅱ氧杂蒽染料（CM1和CM2），采用两亲聚合物F127封装它们来制备水分散的纳米粒子，再通过经典乳化方法制备了两个组件CM1 NPs和CM2 NPs。CM1 NPs显示出明显的ACQ效应且荧光较弱，而CM2 NPs表现出降低的ACQ效应及明亮的荧光，且最大吸收/发射波长扩展到1235/1350 nm。静脉注射CM2 NPs后可以观察到明亮的后肢脉管系统，甚至可以区分邻近的动脉和静脉。此外，具有低背景信号的CM2 NPs可实现超过1300 nm的血管造影。（Figure 1）

Figure 1

作者首先完成了CM1和CM2分子的制备及表征。通过将两个氧杂蒽核与花青染料桥联得到NIR-Ⅱ氧杂蒽染料核心CL1，随后CL1与硫醇进行经典亲核取代反应合成CM1和CM2（CM1 : 3,5 -双（三氟甲基）苯硫醇；CM2 ：2- （4-巯基对苯基）乙酸）（Figure 2a）。随后对其光物理性质进行了考察。CM1和CM2在NIR-Ⅱ区域都表现出较长的吸收/发射波长，在氯仿中的最大吸收/发射波长分别为1180/1220 nm和1160/1200 nm；CM1和CM2的摩尔吸光系数分别约为26800和31300 M-1cm-1，计算出CM1和CM2的荧光量子产率为0.70 × 10-4和0.76 × 10-4（Figure 2b和Table 1）。作者还以市售的吲哚菁绿（ICG）和IR 1061染料为参考，对CM1 NPs和CM2 NPs的光稳定性进行了探索，由于分子刚性更大，CM1和CM2在1064 nm照射下的光稳定性与IR 1061相当，而ICG在808 nm的光照射下迅速漂白（Figure 2c）。

Figure 2

Table 1

作者接着完成了CM1 NPs 和CM2 NPs的制备并对其表征。采用两亲聚合物F127包封CM1和CM2赋予染料用于静脉注射的亲水性，采用经典乳化方法制备两种水分散的纳米颗粒CM1 NPs 和CM2 NPs（Figure 3a）。由透射电子显微镜（TEM）图像得到其平均纳米颗粒尺寸为50和30 nm，由动态光散射（DLS）得到其流体动力学尺寸为126和100 nm（Figure 3b和c），流体动力学尺寸略大于TEM中的颗粒尺寸来源于水化层的包裹。此外，CM1 NPs 和CM2 NPs在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）中表现出良好的稳定性。作者进一步检查它们的吸收和发射光谱发现，CM1 NPs表现出典型的H-聚集现象，最大吸收波长为790 nm（Figure 3d），猜测CM1 NPs的弱荧光强度来源于由H-聚集体导致的ACQ效应，与之相反，由于ACQ效应的显著降低，CM2 NPs比CM1 NPs表现出更高的荧光强度，最大吸收波长为1235/1250 nm（Figure 3e）。作者计算出，分散在水中的CM1 NPs和CM2 NPs的荧光量子产率分别为0.01 × 10-4和0.15 × 10-4。通过体外NIR-Ⅱ荧光成像，作者发现CM2 NPs通过1150和1300长通（LP）过滤器表现出明显的荧光信号，而CM1 NPs则几乎没有荧光信号。此外，CM2 NPs在pH 4-9范围内表现出良好的pH稳定性。由此可见，CM2 NPs可用于1300 nm以上的NIR-Ⅱ荧光成像。

Figure 3

作者接着对CM2 NPs减少ACQ效应的机制进行探究。首先借助MD模拟来帮助理解分子间堆叠方式降低ACQ效应的机制（Figure 4a），如Figure 4b（侧视图）和4c（顶视图）所示，CM2表现出高度扭曲的行为，避免了形成具有庞大平面结构的H-聚集体。将CM2分成三个部分来测量两个相邻分子的分子间距离，如Figure 4b所示，CM2的巯基部分命名为1，两点的氧杂蒽核分别命名为2和3，相邻分子的相应三个部分分别命名为1’、2’和3’。如Figure 4d所示，两个相邻的CM2分子的羧基在2.8 Å的距离处形成氢键。两个相邻分子的秋季垂直距离为3.5 Å，滑动角为46.8°。两个相邻CM2分子的氧杂蒽核2与2’间的垂直距离为4.0 Å，滑动角为46.7°，表现为π-π折叠行为（Figure 4e）。值得注意的是，这两个部分的滑动角几乎相等，均小于J-聚集体的临界值54.7°。而如Figure 4f所示，两个相邻CM2分子的氧杂蒽核3与3’之间的垂直距离为3.7 Å，呈边对面堆叠方式。这种典型的CH-π相互作用有助于形成更稳定的组装体并延长体内循环。作者由此提出，侧链工程驱动的氢键、π-π相互作用及CH-π相互作用降低了CM2的ACQ效应。

作为比较，作者还通过MD模拟探索了CM1 NPs的分子间堆叠方式，证实了CM1的H-聚集行为，解释了CM1 NPs表现出显著的ACQ效应的原因。

Figure 4

作者继续考察了CM1 NPs和CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影性能。将CM1 NPs或CM2 NPs（100 μl， 1 mg/ml）静脉注射到小鼠体内进行后肢血管造影。作者采用1150 LP滤光片截止小于1150 nm的发射，从而尽可能长时间地探索它们在NIR-Ⅱ的成像能力。如Figure 5a所示，CM2 NPs的高荧光强度使得在使用1150 LP的滤光片情况下，仍可以区分明亮精确的血管。而静脉注射CM1 NPs后则没有观察到明显的血管。在Figure 5a中标记横截面线1和2，通过高斯拟合曲线，可得截面线（1）处的血管半峰全宽（FWHM）分别为0.40、0.38和0.37（Figure 5b），而截面线（2）处的血管FWEM分别为0.47、0.50和0.28（Figure 5c）。由此可见，CM2 NPs的高分辨率成像足以成功区分邻近的动脉和静脉，表明了其更好的NIR-Ⅱ血管造影性能。此外，CM1 NPs和CM2 NPs均通过肝胆系统代谢出体外。

随后作者研究了商业染料ICG及IR 1061的血管成像能力，以进行对比。由于808 nm激光的穿透深度及ICG在NIR-Ⅱ窗口的低亮度，静脉注射ICG后无法清楚区分后肢脉管系统（Figure 5d）。与之类似，由于严重的荧光淬灭效应，IR 1061在980 nm或1064 nm激发下静脉注射后几乎无荧光信号被收集到。

Figure 5

作者最后探索了CM2 NPs超过1300 nm的NIR-Ⅱ血管造影性能。由于CM2 NPs在800 – 1400 nm的范围内显示出宽吸收波长，作者首先在808、980和1064 nm处分别探索了CM2 NPs在不同波长激发下的血管成像能力。如Figure 6a所示，采用1150 LP滤波器，CM2 NPs在1064 nm波长激发下的血管图像比在808和980 nm波长激发下更亮。且在1064 nm波长的高亮度下，可用0.39和0.41 mm的FWEM区分邻近的动脉与静脉（Figure 6b）。但无法在808和980 nm波长激发下的血管图像识别邻近的动脉与静脉（Figure 6b）。

作者进一步将CM2 NPs应用于1064 nm激发下超过1300 nm的血管造影。如Figure 6c所示，采用1300 LP的滤光片的血管成像具有比1150 LP滤光片更低的背景信号。横截面线（6）处血管的FWEM分别为0.63和0.52 mm，信号背景比（SBR）为1.27，横截面线（7）处血管的FWEM分别为0.58和0.48 mm，SBR为1.33（Figure 6d）。更出色的是，横截面线（8）处的血管FWEM分别为0.33和0.23 mm，SBR为1.14（Figure 6d），表明1300 LP滤光片的血管成像可以实现毛细血管的区分。由此可知，CM2 NPs能以高分辨率实现对超过1300 nm的血管成像。

得益于1300 nm的高分辨成像，可通过使用超过1300 nm的成像平台区分不同类型的血管。CM2 NPs的荧光光谱中超过1300 nm的更多发射部分可有效应用于血管成像。而CM1 NPs只有很小的尾峰发射部分可以达到1300 nm，这对于1300 nm以上的高效成像是不够的。作者随即考察了CM2 NPs在小鼠体内的毒性，以健康小鼠为对照。血常规指标、血清生化指标以及主要器官的H&E染色图像的结果显示，CM2 NPs可用作安全的荧光体内显像剂。

Figure 6

总结：作者合成了两种带有不同侧链的氧杂蒽染料（CM1和CM2），它们表现出NIR-Ⅱ激发特征、相似的光物理性质和良好的稳定性。通过将染料包封在F127中制备相应的纳米粒子，CM2 NPs显著克服了ACQ效应而CM1 NPs没有，且CM2 NPs表现出高亮度的高效NIR-Ⅱ发射。作者提出减少CM2的ACQ效应的机制为多重相互作用即分子间氢键、π-π相互作用和CH-π相互作用。CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影显示出高亮度与对比度。与NIR-Ⅰ在808 或980 nm激发下相比，CM2 NPs在1064 nm的NIR-Ⅱ激发下的图像具有更高的分辨率，可以区分邻近的动脉和静脉。此外，CM2 NPs能够以低背景信号实现超过1300 nm的血管造影，甚至可以分辨小至0.23 mm的毛细血管。CM2 NPs同时满足体内荧光团的必需条件，对小鼠具有良好的生物安全性。这种由侧链工程驱动的具有降低ACQ效应的新型NIR-Ⅱ氧杂蒽染料极大地拓展了未来NIR-Ⅱ高分辨率生物成像的临床应用。

参考文献

https://doi.org/10.1016/j.bios.2022.114701

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