红花养不养生？它说了算！！黄酮类化合物测定实验

2022-10-08 16:12:27, 孙九凤上海元析仪器有限公司

来源|技术部

编辑|品牌部

校对|孙九凤

导读

红花为菊科植物红花 (CarthamustinctoriusL．)的管状花，为活血化淤中药，常用于血脉闭塞、跌打损伤、疮疡肿痛等。现代研究表明，红花中含黄酮类化合物、酚酸、脂肪酸与挥发油等成分，其主要药理作用包括抗凝血和血栓形成，对心肌的保护作用，降血压、血脂作用，抗氧化作用，对神经系统的保护作用等。因此，红花越来越引起医药和食品研发工作者的广泛关注。黄酮类化合物具有多种功效(如抗自由基、抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗菌及抗病毒活性等)。

本实验利用乙醇为提取试剂，通过实验从芦丁和槲皮素中选择标准品，通过紫外可见分光光度计的光谱扫描功能来确定红花黄酮类化合物的分光光度法实验标准品及实验波长。

实验准备

实验材料及试剂: 红花、芦丁、槲皮素，无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铝均为分析纯。

实验仪器：UV-5200紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）

实验过程

1、标准品配置

1）0.1mg/mL芦丁标准溶液配制：精密称取干燥至恒重的芦丁对照品50mg于500mL容量瓶中，加30％vol乙醇15mL，于30℃水浴锅中加热，使之溶解，放冷，以30％vol乙醇定容，摇匀。

2）0.1mg/mL槲皮素标准溶液的配制：精密称取干燥至恒重的槲皮素对照品50mg于500mL容量瓶中，加30%vol乙醇15mL使之溶解，用30％vol乙醇溶解定容至刻度，摇匀。

2、样品制备

1）红花黄酮粗提取液制备：原料清理、干燥、粉碎，过40目筛，备用。取一定量红花粉状物，加入65％vol乙醇，料液比1：20，30℃充分浸泡20min，置于50％水浴振荡器中，振荡提取2h，过滤，离心取上清液，定容。

2）红花黄酮纯化液制备：取一定量红花黄酮粗提取液，以lmL/min的吸附流速过AB-8大孔树脂柱，至吸附饱和。先用蒸馏水洗去杂质，再用65％vol乙醇以lmL/min的洗脱流速洗脱，至洗脱完全。

3、直接测定法

移取红花黄酮粗提取液、红花黄酮纯化液，芦丁和槲皮素溶液各lmL于10mL具塞试管中，用30％vol乙醇定容，摇匀，在波长200nm-600nm处进行扫描，记录光谱，如图A所示。

4、硝酸铝显色法

分别取红花黄酮提取液、红花黄酮纯化液、芦丁和槲皮素对照品溶液各3mL于3支25mL容量瓶中，各加入30％vol乙醇至10mL，加入5％亚硝酸钠lmL，摇匀，放置5min，然后又加入10％硝酸铝lmL，摇匀，放置6min，再加入4％氢氧化钠10mL，用30％vol乙醇定容，摇匀，放置10min后，进行扫描以不加样为空白。在波长200nm-600nm处进行扫描，记录光谱，如图B所示。

5、氯化铝显色法

移取红花黄酮粗提取液、红花黄酮纯化液、芦丁和槲皮素溶液各lmL于10mL具塞试管中，加入lmL1％三氯化铝(乙醇液)，用30％vol乙醇定容，摇匀，放置10min。以不加样品为空白，在波长200nm-600nm处进行扫描，记录光谱，如图C所示

图A

图B

图C
1.芦丁标准液 2.槲皮素标准液

3.红花黄酮纯化液 4.红花黄酮粗提液

实验结果分析

试验分别对红花黄酮粗提取液、红花黄酮纯化液、芦丁标准液及槲皮素标准液采用不同显色反应后，在波长200nm~600nm处进行波长扫描，结果见图A、B、C。

从图A可以看出，在波长200nm~400nm处，芦丁与槲皮素均存在2个主要的紫外吸收带，即芦丁在波长267nm和363nm处有明显吸收峰、槲皮素在波长256nm和374nm处有明显吸收峰。红花黄酮粗提液与红花黄酮纯化液在波长332nm处有明显吸收峰。可见，芦丁和槲皮素的吸收峰位置与红花黄酮的吸收峰位置吻合性较差，故不能采取直接法测定红花黄酮含量。

图B是硝酸铝显色法的测定结果，也是目前常用的测定黄酮的方法。由图B发现，芦丁加硝酸铝显色后在波长510nm处有明显紫外吸收峰，槲皮素和红花中的主要黄酮类化合物在该法常用的波长510nm处均无明显吸收峰，说明红花中的黄酮物质不具有该显色法所要求的化学基团。因此，槲皮素和芦丁此时均不能选为标准品，同时也可说明，硝酸铝法并不适合红花中黄酮含量的测定。

从图C可以看出，红花黄酮粗提液、红花黄酮纯化液、芦丁与槲皮素在波长400nm~450nm处都有明显的吸收峰，吻合性较好，且吸收锋位置基本一致。在波长400nm~450nm处，芦丁的紫外吸收峰在波长422nm处，槲皮素在波长436nm处，红花黄酮纯化液与红花黄酮粗提液均在波长406nm处。由此可见，芦丁和红花黄酮的吸收峰位置更相近，并且芦丁易得且价格相对更低。因此，试验选择以芦丁为标准品，测定波长为406nm作为测定方法。用芦丁作为标准品绘制标准曲线，分别精密吸取芦丁标准液0mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL与2.2mL，再各加入1.0mL1％三氯化铝，用30％vol乙醇定容至10mL，放置l0min后，在波长406nm处测定吸光度值，并建立回归方程：y=33.673x+0.0046, R2=0.9997